[发明专利]人前脱脂蛋白A-I的表达

说明书

本发明涉及含有为人前脱脂蛋白A-I编码顺序的新的重组DNA序列，含这些DNA序列的克隆和表达载体，用这些表达载体转化的宿主细胞及用这些新重组DNA序列，载体和转化体生产人前脱脂蛋白A-I的方法。

人脱脂蛋白A-I(apo A-I)是组成高密度脂蛋白(HDL)和淋巴乳糜微粒的主要蛋白。肝脏和小肠是合成该蛋白的主要场所。在这些器官内，该蛋白以前脱脂蛋白A-I的前体被合成。该前肽在细胞内被共转译切割，从而将前脱脂蛋白A-I分泌到血浆和淋巴液中。

前脱脂蛋白A-I有6个附加氨基酸(Arg-His-Phe-Trp-Gln-Gln)，它们连接在脱脂蛋白A-I的氨基末端。当到达血管间隙时，该前体蛋白被一种特异蛋白酶(脱脂蛋白A-I前肽酶)酶解，得到成熟的脱脂蛋白A-I。

成熟的脱脂蛋白A-I是由243个氨基酸残基组成的已知序列的一条未糖基化多肽(H.B.BREWER et al.，Biochem.Biophy.Res.Commun.80，(1978)，623-630)；它作为血浆卵磷脂酶的一个辅助因子：胆固醇酰基转移酶负责血浆中大部分胆固醇酯的形成。脱脂蛋白结构或生物合成上的缺陷可以导致血浆脂类转运系统的紊乱和冠状动脉疾病的发生。脱脂蛋白A-I和HDL在血浆中低水平是引起心脏病(心肌梗死)和其他动脉粥样硬化性疾病的重要危险因素之一。为脱脂蛋白A-I编码基因的突变与HDL水平的降低及早期冠状动脉疾病有关。脱脂蛋白A-I和DHL是主要的血浆成分，其参与胆固醇从外周组织(动脉)向肝脏的转运(称之为胆固醇反向转运)而使之从体内排出。由于胆固醇在血管中的积累是一个通道标志(hall-mark)和动脉粥样硬化最重要的过程，通过供应脱脂蛋白A-I刺激胆固醇反向转运，可以推迟和逆转动脉粥样硬化的进程，从而减少心脏病的发生。由前脱脂蛋白向脱脂蛋白A-I的熟化能以在血液中滞留时间不超过12小时的速率，在细胞外大量地发生。由于前脱脂蛋白A-I，既使不是唯一的，也是主要的成熟脱脂蛋白A-I的前体，它可用于治疗任何时侯的低HDL水平性疾病，如：先天性或获得性缺陷病。由于脱脂蛋白A-I可用于治疗，所以很多研究人员都在寻找大量生产脱脂蛋白A-I的技术。一般说来，这些技术都涉及从血浆中分离纯化该蛋白。

一些出版物(P.CHEUNG and L.CHAN，Nucleic Acids Res.11.(1983)，3703-3715；J.J.SEILHAMER et al.，DNA，3，(1984)，309-317和日本专利申请No96998/86)均指出可用已知的遗传工程技术得到为前脱脂蛋白A-I编码的cDNA。R.LORENZETTI et al.，(见FEBS Lett.194，(1986)，343-346.)也指出脱脂蛋白A-I可以来切割的与β-半乳糖苷酶融合蛋白形式在大肠杆菌中表达。然而，令其以非融合蛋白形式表达成熟的脱脂蛋白A-I的努力一直未获成功。

上面提及的日本专利申请No96998/86叙述了在大肠杆菌中表达人脱脂蛋白A-I的类似蛋白，该菌株是用含在tac启动子控制下的脱脂蛋白A-I结构基因的质粒PHAIE-I转化的。然而，该结构基因是不完整的，它由从+4到+243氨基酸的密码子组成，开始于ATG转译起始密码子。因此，所得表达产物含有N-端蛋氨酸(对应ATG密码子)，当其用于治疗时会有副作用。

J.B.MALLORY等人(J.Biol chem.262，(1987)，4241-4247； PCT国际专利申请WO86/04920和WO87/02062)揭示了在中国仓鼠卵巢细胞(动物细胞培养物)中表达人脱脂蛋白A-I。所用组建细胞含整个人前脱脂蛋白A-I的基因。中国仓鼠卵巢细胞看来可将前脱脂蛋白转化为成熟的脱脂蛋白形式，因为只有5-10％分泌的脱脂蛋白A-I蛋白质是前脱脂蛋白A-I，其余均为成熟的脱脂蛋白A-I蛋白。但该系统的产率相对较低，在24小时内0.55×10⁶个细胞只分泌25-30μg/ml的脱脂蛋白A-I。在PCT国际专利申请WO87/02062中，有一些例子是有关人脱脂蛋白A-I在其它宿主中的表达，如：在大肠杆菌(细菌宿主)和酿酒酵母(酵母菌)中。所用组建的菌株不含前脱脂蛋白的遗传信息，所以所得蛋白不是人前脱脂蛋白A-I。