[其他]一种除去百日咳内毒素的方法，一种百日咳类毒素及生产方法

说明书

本发明涉及一种除去百日咳内毒素的方法、一种百日咳类毒素及其生产方法。

百日咳是一种由百日咳博德特氏菌（Bordetella    pertussis）引起的传染性疾病，其可在患儿体内造成严重的病理过程。

已经使用疫苗来预防这种疾病，但使用任何一种由百日咳博德特氏菌整个菌体生产的疫苗时，都会出现发烧等强烈的不良反应，为了克服这一缺点，目前已通过分离细菌的抗感染部分（下文中亦称之为保护部分）-如菌丝血凝素（FHA）、百日咳毒素（PT）及菌毛而生产了一种基本上没有内毒素（ET）（其为引起发烧等不良反应的主要因素）的无细胞百日咳疫苗（ACP疫苗），并已在临床上付诸使用。

生产ACP疫苗的最关键性步骤是从抗感染部分中分离出内毒素（ET），而为此目的已普遍使用了蔗糖梯度离心法（日本未审查专利公开57-50925号，即相当于EPC公开0047802号）。

此外，作为一种除去热原的技术，已知有使用磷酸钙凝胶的方法（日本专利公开34-2149号）。也知道羟基磷灰石凝胶-磷酸钙凝胶的一种稳定化变体，在从百日咳毒素（PT）中分离菌丝血凝素（FHA）上是有效的，而且已知可在羟基磷灰石凝胶柱上由百日咳毒素中层析分离出无内毒素（或基本上无内毒素）的菌丝血凝素，并可经亲合层析和蔗糖梯度离心进一步纯化之（Japanese    Journal    of    Bacteriology，38（1），423，1983）。

单用蔗糖梯度离心法虽然能除去99.995%的内毒素（ET），但作为含抗感染部分的液体粗提物，其仍富含内毒素（ET），可见很难将保护性部分与内毒素（ET）完全分离开，而且抗感染部分的产率也不高。再者，因为生产体积小而且成本高耗时多，所以这种方法不能够满足商业化生产的需要。

另一方面，单用磷酸钙凝胶处理只能保证达到90～99.9%的低内毒素排除率，因此没有什么实用价值。联合使用羟基磷灰石柱层析、亲合层析及蔗糖梯度离心方法，有可能在实验室水平上在与百日咳毒素（PT）的分离中分离和纯化出完全没有内毒素的菌丝血凝素（FHA），但这种方法所获产品的产量却不能符合商品化生产的要求。此外，所涉及的技术在目的上，亦不同于本发明由含有保护性部分及内毒素（ET）的液体除去内毒素（ET）这一发明目的。

与上述技术背景不同，我们则是探索除去内毒素（ET）的有效方法，并发现在进行蔗糖梯度离心之前先用磷酸钙凝胶处理，可以很彻底地将保护性部分与内毒素（ET）分离开，而且可经蔗糖梯度离心进一步提高产量和内毒素（ET）的清除率。针对这些发现作进一步的研究，最后确立了本发明。

因此本发明提供了（1）一种经区域离心由含有I期百日咳博德特氏菌菌株之抗感染性部分和内毒素的液体中除去内毒素的方法，特征在于于区域离心前在过量磷酸跟离子存在下向所说的液体内加入钙离子，并弃去所形成的沉淀;（2）一种生产百日咳类毒素的方法，特征在于对依照上述方法制得的含抗感染部分的液体作解毒处理;以及（3）一种其内毒素含量为每10μg蛋白氮不超过0.5ng的百日咳类毒类。

使用本发明的除去百日咳内毒素的方法，可以使从内毒素中分离抗感染部分的工作做得更为肯定和彻底，结果是能比较容易地以更高收率分离到保护性部分。此外，因为可进行区域离心的原料量大并能以高效率除去内毒素，从而可使百日咳类毒素的产量增加两倍以上。因此，本发明的工业价值是很大的。

再者，与以常规方法生产的类毒素相比，依据本发明的方法生产的百日咳类毒素中内毒素含量不超过前者的十分之一，而且使用本发明的百日咳类毒素能在工业水平上生产出与常规疫苗有同样免疫学作用的疫苗，且降低了产品的毒性。

前述含I期百日咳博德特氏菌菌株之抗感染部分和内毒素的液体，例如可以是经培养I期百日咳博德特氏菌菌株所得培养物的上清液或其浓缩液，且最好是浓缩液。可依照常规方法培养I期百日咳博德特氏菌的菌株。例如，可使微生物在液体培养基（如Cohen-Wheeler培养基或Stainer-Scholte培养基）中于35-37℃下生长约5-7天。可用过滤或离心方法收集如此得到的培养物的上清液。可直接或于浓缩后，对上清液作进一步处理以除去内毒素。为此目的，可用已知的盐析技术进行浓缩。例如，可将2至5kg硫酸铵加到各10升培养物上清液中，并用过滤或离心等方法收集所产生的沉淀物。然后将该沉淀物溶解在适当量的1M氯化钠-0.05M磷酸盐缓冲液中，并以离心或其他方法处理溶液，以分离上清液。