[发明专利]多色的韦斯特恩印迹法

说明书

本申请是1987年1月20日已提交待批的申请号为004464的美国专利的后续申请。

本发明涉及蛋白质、蛋白质片段、糖蛋白、脂蛋白及其混合物（以下简称为蛋白质）的检测方法，更具体地说，本发明涉及蛋白质检测的Western印迹技术和斑点印迹技术。

已经知道，当蛋白质从电泳凝胶转移至蛋白吸附基质上时会形成Western印迹，该基质将转移的蛋白质固定在相应于它们在凝胶中的定位处。参阅Gershoni等人的“蛋白质印迹法：原理和应用”Analytical    Biochem.131∶1-15，1983中的有关部分。

固定在蛋白吸附基质上以后，通过使基质与探针保温而测定特定蛋白质的定位，所谓探针是指专一于一种或多种蛋白质的结合体，这些蛋白在基质上的存在或定位有待测定。例如，基质可与抗体、抗原、凝集素或其他类似物进行保温。

探针可在与基质保温之前进行标记，或可以在基质上进行标记，即使之与专一于第一探针的第二标记探针反应，例如，来自第一动物的抗特定蛋白的未标记抗体，可通过第二动物的标记抗体在基质上进行标记，这种第二动物的标记抗体通常与第一动物的抗体结合。使用的标记包括放射性标记、酶联标记以及连接到荧光标记上。见Gershoni等人的上述文章第9页。就放射性标记来说，通过使印迹与感光胶片接触而制备印迹的放射自显影图，即使与印迹结合的放射性探针的位置在胶片上曝光。

在本发明之前虽然推荐和试验了几种方法，但是，在用Western印迹技术测定多种蛋白质在电脉凝胶中的位置方面还没有一个方便实用的方法。例如，从前所用的方法是，从凝胶至一系列基质进行多次转移，接着使用不同的探针使每个基质显色。见Legocki等人的“多重免疫复制技术：用一种聚丙烯酰胺凝胶和一组不同抗体筛选特定的蛋白质”，Analytical    Biochem。111：385-392，1981;Lin等人的“用单克隆抗体通过Western印迹的酶联免疫吸附试验对EB病毒早期抗原扩散组分进行定性和定量分析”，J.Virol.53：793-799，1985.显然，由于需要进行多次转移从而使这一技术很不方便。见Erickson等人的“多肽从SDS聚丙烯酰胺凝胶至硝化纤维素片的定量电泳转移：在抗原的放射免疫自显影中重复使用的一种方法”，J.Immuno，Methods51：241-249，1982中的第248页。而且，正如所公认的那样，难以保证所有的印迹如实地代表原始蛋白质在凝胶上的图形。见Gershoni等人的上述文章第8页。

为了避免进行多次转移，发展了使用放射性标记的技术，其中1）用第一探针检测印迹，2）使印迹进行放射自显影，以及3）从印迹中洗脱第一探针，随后用一个或更多的另外探针重复该程序。见Erickson等人的上述文章，Gershoni等人的上述文章第9-10页;Gullick等人的“来自鱼放电器官和哺乳动物肌肉的乙酰胆碱受体之间的结构相似性”，Biochemistry21：4563-4569，1982;Legocki等人的上述文章;Olmsted，J.B.的“从异种蛋白质样品的重氮化纸上印迹中对抗体进行亲和纯化”，J.Biol.Chem.256：11955-11957，1981;Reiser等人的“通过凝胶分离和转移至重氮苯基硫醚纸上对总细胞提取物中特定蛋白质的免疫检测”，Eur.J.Biochem.114：569-575，1981;Renart等人的“蛋白质从凝胶至重氮苄氧基甲基-纸的转移和用抗血清检测：一种研究抗体专一性和抗原结构的方法;”，Proc.Natl.Acad.Sci.USA76：3116-3120，1979;Symington等人的“从凝胶到重氮纸进行电泳转移后蛋白质的免疫放射自显影检测：腺病毒编码蛋白质的分析”，Proc.Natl.Acad.Sci.USA78：177-181，1981。这种多次放射自显影法虽然好于多重印迹法，但也有其自身的问题，一个主要问题是为了测定单带的精确位置，在校准一系列放射自显影方面有困难。显然，当试图区别有相似分子量的蛋白质时这一问题将是最严重的。而且，正如多重印迹法的情况一样，由于需要制备、鉴别和贮存有关单一凝胶的多次记录，因此多次放射自显影法从根本上讲是很麻烦的。