[其他]通用的核酸内切限制酶

说明书

本发明涉及新的通用的核酸内切限制酶类以及生产这种内切酶类的方法。更具体地说，藉着一种寡脱氧核苷酸接合体与一种已知的核酸内切限制酶结合，本发明涉及到的核酸内切限制酶使人们在实际上可裂解任何预定的DNA序列。

核酸内切限制酶是一类在细菌体内自然产生的酶类。当将它们从其它的干扰的细胞组分中提纯出来后，就可在实验室中用来将DNA分子切割成精确的片段，此种性质能使DNA分子成为异常等同的及精确地分离成其组分亚单位。已经证明，核酸内切限制酶类是当今遗传研究中不可缺少的工具。它们是生物化学的“剪刀”，可应用来进行遗传工程及分析。

核酸内切限制酶可分为三类。在相同的蛋白质部份中，类-Ⅰ及类-Ⅲ酶承担饰变（甲基化作用）及一种ATP-需要的限制性（裂解）活性。两种类型的酶都可识别在基质DNA中未甲基化的识别序列，但是类-Ⅰ酶类的裂解基本上是不规则的，而类-Ⅲ酶类则在特定的位点上切割DNA，通常是在距它们的识别位点上的一个恒定的距离来切割。

类-Ⅲ限制/修饰系统包括一种分隔的核酸内切限制酶及修饰甲基酶。这些酶在DNA上接近特殊的识别序列处或在序列内切割DNA，典型的识别序列其长度为4至6个核苷酸单位，通常是两个弯折对称轴的距离。存在着多于500个的可在DNA上特定的位点裂解DNA的类-Ⅱ核酸内切限制酶。不同的识别位点的数目大于100（不算各种修饰作用，包括甲基化作用）（参阅Roberts，核酸研究，13∶r165，1985;Kessler等人，基因，33∶1-102，1985）。虽然存在的裂解位点的所有数目其数值很大，但仍常常需要增加切割位点，使之有可能进行精确的基因工程及调整序列。目前，还不能有效地评估一个序列中何处是最有利的限制性位点，人们通常应用多种的方法来建造序列，包括插入适当的连接子，突变的产，或核酸外切分离的消化作用（exonuleolytic    digestion）。但是，这些创造新位点的方法改变了所研究的核苷酸序列并经常会影响其功能。

按照本发明，提供了对于限制性酶类工程的一种新的途径，而这种酶能够在特别预定的位点上裂解DNA。在一种具体的实施中应用了类-ⅡS或“转换”酶。类-ⅡS酶类的定义为可在双股（简称ds）DNA上距识别序列的精确距离处裂解该DNA的类-Ⅱ核酸内切酶类。某些类-Ⅲ酶类也可在实施本发明中应用，特别是能够在距DNA链识别位点的一个适当的恒定距离处（在约20-25核苷酸）裂解DNA的那种类-Ⅲ酶类。用于切断两个识别位点（例如，BstⅪ酶;见基因40∶173（1985））之间的位点的类-Ⅱ酶类也可应用于本发明的技术中。

本发明藉酶与一种适当地设计好的寡脱氧核苷酸接合体，利用识别位点与切割位点之间的分隔，使类-Ⅱ或类-Ⅲ酶类实际上能切割几乎任何预定的序列。接受体是由恒定的识别位点区域（一种含发夹结构的双股序列）及一种可变的，与被裂解的靶单股序列互补的单股（以SS表示）区域构成。被裂解的单股序列可由单股噬菌体DNA，有缺口的ds质粒，碱变性和迅速中和的超螺旋化ds质粒或其类似物等所提供。这三种组分的混合，即类-ⅡS酶，SS    DNA靶序列，及互补的接合体，形成一种新的核酸内切限制酶复合体，此复合体可使靶DNA在特定的位点上裂解。本发明的另一个优点是应用适当DNA聚合酶、利用接合体寡脱氧核苷酸作为一种引物，可将靶SS    DNA转变成精确裂解的ds    DNA。

因此，根据本发明，提供了一种利用合成的设计而产生的一种具有预定限制的特异性，而实际上几乎是无限多的各种各样的新核酸内切酶，从而改变核酸内切限制酶特异性的方法。

图1    说明一种用于指示FokⅠ类-ⅡS酶在一个预定的点上裂解M13    SS    DNA的寡脱氧核苷酸接合体的设计方案。

图2    说明供FokⅠ核酸内切限制酶使用的两个寡脱氧核苷酸接合体。

图3    表示M13mp7    SS    DNA的示意图。

图4    表示由FokⅠ、HphⅠ、HpaⅠ、MboⅡ、MnlⅠ、SfaNⅠ及BbvⅠ的凝胶消化ds及SS    M13mp7    DNA的翻印照片。

图5    说明一种寡脱氧核苷酸接合体及它对FokⅠ裂解的非敏感性结构。

图6    说明在图2中说明的32-单体及34-单体接合体的存在下，M13mp7的FokⅠ消化作用的凝胶图片。