[发明专利]利用啤酒酵母基因BARI分泌异种蛋白的方法

权利要求书

1、一种在转化细胞中生产异种蛋白和将所述蛋白引向细胞分泌途径的方法，其特征在于该方法包括下列步骤：

(a)用DNA结构体转化真菌宿主细胞，该DNA结构体包括编码主要由起始于蛋氨酸的BAR1基因的氨基末端顺序编码的24至405氨基酸组成的多肽的部分啤酒酵母BAR1基因、编码所述异种蛋白的结构基因和在所述包括该信号肽和异种蛋白的融合蛋白的细胞中控制表达的启动子；

(b)在适于为生产所述融合蛋白进行选择的生长条件下，培养步骤(a)中所述的细胞。

2、根据权利要求1的方法，其中所述真菌是啤酒酵母。

3、根据权利要求1的方法，其中所述真菌是梨酒酵母。

4、根据权利要求1的方法，其中所述真菌是曲霉菌或脉胞菌。

5、根据权利要求1的方法，其中所述融合蛋白包括一个KEX2加工位点。

6、根据权利要求5的方法，其中所述部分BAR1基因含有降低信号肽酶裂解蛋白效率的突变体。

7、根据权利要求1的方法，其中所述启动子选自啤酒酵母BAR1启动子、啤酒酵母乙醇脱氢酶Ⅰ启动子的梨酒酵母乙醇脱氢酶启动子。

8、根据权利要求1的方法，其中所述启动子是酵母糖酵解途径基因的启动子。

9、根据权利要求8的制备DNA构建体的方法，其中所述构建体选自：

（a）通过连接BAR1启动子、含有信号肽的部分啤酒酵母BAR1基因和编码所选择宿主的外源蛋白或外源多肽的至少一个结构基因制备构建体pZV30，使在由所述DNA构建体转化的宿主细胞中的表达形成含有所述信号肽和外源蛋白的融合蛋白或多肽;

（b）通过连接BAR1启动子、含有信号肽的部分啤酒酵母BAR1基因和编码所选择宿主的外源蛋白或外源多肽的至少一个结构基因制备构建体pZV31，使在由所述DNA构建体转化的宿主细胞中的表达形成含有所述信号肽和外源蛋白的融合蛋白或多肽;

（c）通过连接BAR1启动子、部分梨酒酵母BAR1启动子、含有信号肽的部分梨酒酵母BAR1基因和编码所选择宿主的外源蛋白或外源多肽的至少一个结构基因制备构建体pZV49，使在由所述DNA构建体转化的宿主细胞中的表达形成含有所述信号肽和外源蛋白的融合蛋白或多肽;

（d）通过连接啤酒酵母ADH1启动子、含有信号肽的部分啤酒酵母BAR1基因和编码所选择宿主的外源蛋白或外源多肽的至少一个结构基因制备构建体pZV50，使在由所述DNA构建体转化的宿主细胞中的表达形成含有所述信号肽和外源蛋白的融合蛋白或多肽。

10、根据权利要求1的方法，其中所述异种蛋白从所述细胞中输出。

11、根据权利要求1的方法，其中所述蛋白包括胰岛素原或胰岛素。

12、根据权利要求1的方法，其中所述部分BAR1基因还包括邻接转译起始位点的5′-未转译区的680硷基对顺序。

13、根据权利要求1制备DNA构建体的方法，其中所述方法的进一步特征在于啤酒酵母磷酸丙糖异构酶基因的转录终止区与所述结构基因连接。