[其他]培养原生质体的方法

说明书

本发明是关于培养原生质体的方法;进一步说来，本发明是关于在液体介质中培养原生质体的方法，借以从这种原生质体中产生细胞群或愈伤组织（Callus）。

原生质体是除去细胞壁的植物、细菌、真菌等等的细胞。由于原生质体没有细胞壁，所以它容易受到例如细胞融合、基因操纵和人工体细胞突变等人工操纵。因此，如果能够从某种受操纵的原生质体再生完整植株，那么就可以获得具有某种野生植物所不具备的优良特性的植物。对于许多植物来说，已知可以从愈伤组织或细胞群再生完整植株;因此，如果能够从原生质体产生出愈伤组织，那么就有可能由该愈伤组织再生出某种完整植株，依次从这种原生质体再生出完整植株。

对于例如烟草等双子叶植物，已知一些能够从原生质体再生出完整植株的方法。但是，对于诸如水稻麦和玉米等属于禾本科的植物来说，仅仅报导有玉米和牧草的完整植株被再生出来的方法。正如下面将要提到的那样，对于水稻来说，报导过的方法却极为稀少。原生质体的传统培养方法包括：利用将原生质体包埋在半固态琼脂介质中培养原生质体，将原生质体悬浮在液体介质中，以及利用喂养细胞培养原生质体等方法。然而已经发现，这些方法对于培养其它植物来说，例如对于包括水稻、麦和玉米的属于禾本科植物来说，常常是无效的。例如，假如用这些方法之一来培养水稻的原生质体，则该原生质体死亡或不能生长。

对于水稻原生质体的培养方法：已经报导了由某种原生质体产出了一种愈伤组织，而该原生质体是从缺少硝酸盐还原酶的某种细胞获得的（Wakasa等人，J.PlantPhysiol.，117，223-231页，1984），另外还报导了由某种花粉的愈伤组织得到了某种原生质体，进而由此原生质体衍生出某种愈伤组织，再由其产出幼芽（Ohno等人，JapaneseJournalofBreeding，35，54-55页，1985）。但是，这些方法利用的是由特定的愈伤组织释放出的原生质体，而且对于由各种愈伤组织或组织中释放出来的各类原生质体来说不能全部适用。换句话说，这些方法对于绝大多数原生质体来说不能再现。

另一方面，许多研究者报导过由培养的水稻细胞再生完整植株（Nishi等人，Nature，219，508-509页，（1968））。但是这些方法並不利用原生质体。而且发现，由这些方法中使用的、具有高度分化能力的细胞，很难得到原生质体，而且该原生质体也难于培养。

因此，需要建立一种培养原生质体的方法，利用这个方法可以从该原生质体中衍生出某种愈伤组织或细胞群，该方法可以再现而且可以用于起源於普通植物细胞或非特定植物细胞的原生质体。

本发明目的在于提出一种培养原生质体的方法，利用此方法可以从该原生质体衍生出细胞群或愈伤组织，该方法可以再现並且可以用于那些来源于普通植物细胞或非特定植物细胞的原生质体。

按照本发明方法，在PH不高于5.2的液体介质中培养原生质体。在传统的培养原生质体的方法中，将培养介质的PH调节到5.5-6.0。本发明基于本发明人等的意外发现，即培养介质的PH被调节到5.2或更低，则原生质体生长良好而且形成细胞群。

按照本发明方法，不仅双子叶植物的原生质体，而且甚至于单子叶植物的原生质体也可以很好地生长，形成愈伤组织或细胞群。

正如上述的那样，在本发明方法中，于PH不高于5.2的液体介质中培养原生质体。液体培养介质的PH，优选值为3.5-5.2，更优选4.0-4.7。可以用加入酸（在某些情况下加入碱）的方法调节PH。调节PH时可以使用任何酸（或碱），只要它不产生对原生质体生长的不利影响就可以使用，为此通常使用HCl和KOH。