[其他]克拉瓦雷酸及其盐和酯的制备方法

说明书

本发明涉及克拉瓦雷酸（暂译此名，原文为Clavulanic    Acid）及其可供药用的盐和酯的制备方法。

克拉瓦雷酸即（2R，5R，Z）-3-（2-羟亚乙基）-7-氧代-4-氧杂-1-氮杂双环〔3，2，0〕-庚烷-2-羧酸是一种已知的化合物，其结构如下：

该化合物及其盐和酯，可作为β-内酰胺酶抑制剂，能抑制由革兰氏阳性和革兰氏阴性有机体所产生的β-内酰胺酶的活动。因此这些化合物可用在药物成份里，以防止β-内酰胺抗生素的失活。此外，克拉瓦雷酸本身也具有抗菌活性。

克拉瓦雷酸是由各种不同菌株的微生物产生的，例如，这些菌珠属于链霉菌属的有：S.Clavuligerus    NRRL3585（美国专利4110165），S.jumonjinensis    NRRL5741（英国专利1，563，103），S.Katsurahamanus    IFO13716（日本专利83，009，579）和链霉菌属球菌（SP.）P6621FERM2804（日本专利55，162，993）。

人们一直通过改进发酵过程来提高克拉瓦雷酸的产量。例如英国专利1，571，888透露，严格地将pH控制在6.3至6.7范围内可以显著地增加产量。

增加产量的办法，更常用的是改进纯化过程。例如，由于克拉瓦雷酸的盐通常比游离酸更稳定，因此，可采用其盐，例如碱金属和碱土金属的盐来增加萃提产量。

美国专利4，110，165叙述了一种基于克拉瓦雷酸及其盐在水相和有机相之间溶解度不同的萃取过程。在萃取之后还要用吸附剂提纯几次。因此，这种萃取方法过于沉长又不经济。

所以，直接从有机相将克拉瓦雷酸结晶出来更为理想。按西班牙专利494，431的办法，是在有机相中加入胺，如叔丁胺，可以使克拉瓦雷酸直接从有机相中结晶出来，然后与一个碱交换，就可转化成钾盐。

锂盐也被认为是一种制备克拉瓦雷酸的有用的中间体，因为它溶解度低而且很容易转化成可供药物制剂采用的盐和酯。例如，美国专利4，490，294透露，克拉瓦雷酸溶液与离子型的锂化合物的水溶液反应可生成克拉瓦雷酸锂。英国专利1，543，563透露了另一种制备克拉瓦雷酸锂的路线，该路线是采用经粒状炭过滤后的肉汤进行吸附，再用离子交换树脂处理，然后将克拉瓦雷酸锂进行结晶。

也有人提出，发酵的肉汤直接吸附在树脂上之后，用异丙醇作溶剂将克拉瓦雷酸锂结晶出来。这个过程很难实现而且产量极低。

由此看来，采用现有技术的发酵和纯化方法，只能制得不纯的克拉瓦雷酸，而且产量相当低。

根据本发明的第一个方面，本发明提供一种利用繁殖的微生物在培养基中发酵的方法制备克拉瓦雷酸的方法，按照这种方法，在发酵过程中至少要加入部分的可同化碳源。可以相邻，不受理论所限制，若有控制地加入碳源就不会出现降解代谢调节。不管理论是怎么说的，现已观察到，在发酵过程的任何一个时间，小心地避免碳含量变得太高，就可以使发酵获得显著的改进。下面列举一些比较理想的实施例子：

将可同化碳源的含量保持在低于2%较为理想，低于1%则更好（对于固体碳源，百分率是以重量/体积作根据，对于液体碳源，则以体积/体积作根据）。同样道理，将碳源加入到有效培养基中时，应以少量加入为宜，可采用分批加入，也可采用连续加入。但无论采用哪种加入方式，碳源的加入量，相对于培养基来说，以不超过1%为好，不超过0.5%更好。实际上，培养基中碳含量维持在低于0.25%，例如低于0.15%比较好。任何可同化碳源都可使用，包括多羟基化合物或碳水化合物，但最好是采用一种化学结构明确的碳源（亦即是一种化学结构已知的含碳化合物）。确定的碳源的分子量一般低于500。分子中所含碳原子数目最多为12个比较合适，例如单糖或双糖，或线型多羟基化合物。这类化合物的例子包括麦芽糖和甘油。本发明另一较佳的选择，可同化碳源是糊精，淀粉或糊化淀粉，更广泛地说，碳源通常是可溶于水或可溶混于水的。

S.clavuligerus的应用，特别是S.clavligerus    NRRL    3585，现在较为普及。对于这些微生物，较适合的碳源包括麦芽糖，甘油，糊精和糊化或未糊化的淀粉。葡萄糖、果糖、蔗糖和乳糖不太容易被S.clavuligerus同化，所以对于这类微生物不太适用。