[发明专利]具有改进杀虫性能的苏云金芽孢杆菌的制备方法

说明书

本发明涉及具有杀虫活性的产毒细菌新菌株的制备方法及生成的新菌株和使用这种细菌以防止植物受某些害虫的影响。

更确切地说，本发明涉及在防治鳞翅目虫害方面具有改进杀虫活性的苏云金芽孢杆菌（Bacillus    thurigiensis）的新菌株。

许多市售的和/或国产的重要植物易受到鳞翅目虫的侵袭和伤害，世界各地普遍发现了这些虫害，当前，控制它们需要重复使用现有的昂杀虫剂。

许多农作物对大量的鳞翅目害虫敏感，其中，最值得注意的害虫为斜纹夜蛾（Spodoptera    littoralis），棉铃虫（Heliothis    armigera），美洲烟夜蛾（Heliothis    Virescens），小菜峨（Plutella    maculipennis），甘蓝夜蛾（Mamestra    spp）和大菜粉蝶（Pieris    brassicae）。

广谱杀虫剂是保护农作物有用和重要的工具，但是，滥用广谱化学杀虫剂会破坏许多天然控制剂。因为大多数化学杀虫剂相对来说是无选择性的，它们可能破坏非目标生物体，包括消灭虫害的有益的动物和寄生物。某些昆虫还会产生对化学杀虫剂的抗性，从而常常使次要的虫害变成主要的虫害。

采用有选择性的微生物杀虫剂，利用天然产生的细菌作为活性和具有宿主特异性的组分，有助于克服许多这些问题。

微生物杀虫剂的一个例子是苏云金芽孢杆菌，它的大量菌株是市场上可得到的，目前正在开发利用它被敏感幼虫，特别是鳞翅目昆虫的幼虫吞食后所具有的独特的杀虫活性。

使用这些菌株益虫无副作用。苏云金芽孢杆菌恰好符合现行的农业 理论，这种理论支持使用天然产生的生物体来抑制有害的昆虫。苏云金芽孢杆菌是一个广泛分布的杆状的，形成孢子的需氧的革兰氏阳性微生物，其特征在于，在孢子形成的周期中，产生一种或多种蛋白质伴孢晶体，对鳞翅目幼虫的致病性，用柠檬酸作为唯一碳源能力;及其孢子中的特别高的磷酸含量。

苏云金芽孢杆菌是一个周围环境中的普通的栖居物，并且能够在一定类型的土壤中生长。目前，尚未了解苏云金芽孢杆菌对人，家养动物鸟类、鱼类、蚯蚓、大多数益虫或植物这样一些生命形式有不利影响。它对敏感昆虫的致病性主要是由于伴孢晶体的存在，在形成孢子时，这种伴孢子晶体可占细胞干重的30-40%。

苏云金芽孢杆菌仅仅在被吞食后才具有活性。鳞翅目害虫在吞食若干小时后停止进食，并停止对植物的损害。由于这种晶体毒素，大多数种类的害虫在大约24到72小时后死于毒血症。有时，还伴随有由于孢子存在而带来的败血病。

因此，它的基本作用在于只有在幼虫的肠中溶解后才起作用的晶体。

晶体活性是由于肠内碱性pH值和蛋白水解酶的共同作用产生的。反应依赖于鳞翅目幼虫肠中的高pH值（pH＞7），这种高pH值会使晶体的毒素组分释放出来。这些毒素使肠中壁发生故障，引起停止进食。

这样释放到腹腔中的细菌的生长导致败血病，它在昆虫的死亡中可能也起部分作用。

很清楚，使用苏云金芽孢杆菌作为杀虫剂，提供了有效的和环境上许可的防治鳞翅目虫害的方法。

由于这一原因，当前正致力于寻找具有改进杀虫剂活性的新菌株，它们对给定种类的害虫有更大的毒性或是具有更广谱的杀虫活性。然而，在实践中，要同时获得高毒性和广谱活性是很困难的。

目前已经发现，苏云金芽孢杆菌的一个新菌株GC-91，在防治鳞翅 目害虫方面具有杀虫活性的其衍生物或突变体。该菌株的样品已经寄存在伦敦NW95HT    Colindaie大街，国家典型培养物收集中心（NCTC），中央公共健康实验室，登记号：NCTC11821，于1984年9月7日储存。该菌种也已于1985年10月5日保藏在中国北京中关村，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC    No.0047。

新菌株有效结合了苏云金芽孢杆菌两个菌株的强烈的杀虫活性，其中之一是不产生孢子的突变株，它不呈现杀虫活性，尽管它含有如果产生孢子或晶体就能使它具有杀虫活性的遗传物质。因此，使用两种突变株的简单混合物得不到该新菌株GC-91的奇特效果。

新菌株在防治大蜡螟属（galleria）、甘蓝夜蛾（Mamestra）棉铃虫属（Helioth-is）、粘虫属（Spodoptera）和粉蝶属（Pieris）等鳞翅目虫害方面具有改进的杀虫活性。