[其他]海产绿藻之培养方法

说明书

本发明系关于海产绿藻的培养方法，尤指可提高 廿碳五烯酸含量，以提高所培养的海产绿藻中总脂价 含量。且可加速生育速度的海产绿藻的培养方法。

廿碳五烯酸(Eicosapentanoic acid以下简称 EPA)是生物体内各种前列腺素(Prostaglandin)关 联物质的前驱体。近年来因发现具有抗血小板凝集 等生理活性，颇受瞩目。以往EPA虽可由鱼油分离 精制，但对鱼油中的总脂质而言，EPA含量低至 10-15％左右，且在鱼油中，EPA以外的高纯度不 饱和脂肪酸中，含有较大量与EPA构造相似的脂肪 酸，不容易进一步加以浓缩。

另方面，海产绿藻在一定条件下培养时，其 EPA含量可达相当于总脂肪酸含量的30％左右或 以上，比鱼油为高。然而，海产绿藻的生育速度慢，且 总脂肪酸含量低，故绝对量亦低，为其问题所在。

因此，本发明的目的，在于提供一种海产绿藻的 培养方法，可提高总脂质量(因而可提高EPA含量) 而且可提高生育速度。

依照本发明所提供的海产绿藻的培养方法，是利 用海水系培养基培养海产绿藻，其特征为在该培养基 中，添加选自碳酸氢盐，乙酸和乙酸盐中至少一种为 碳源，并加生物素加以培养。

本发明所述的海产绿藻应理解为本技术领域中 所定义的海产绿藻，包括Chlorella Minutissima和 Chlorella Bulgaris等。

如上所述，本发明的海产绿藻的培养方法，其特 征在于所采用的培养基是在海水系培养基中添加特 定碳源及生物素。

所用基本培养基，凡天然海水或人工海水(总称 海水培养基)均可用。然而，在培养基中的氯化 钠浓度按重量计以0.1-0.2％为佳(使用天然海 水时，可借加水等以调节其浓度)。氯化钠含量超出 此范围时，生育速度会显著下降，附带降低EPA含 量。

依照本发明，在上述海水系培养基中所添加的碳 源，有碳酸氢盐，乙酸，乙酸盐，或其中任意二种以上 的混合物。此碳源的添加量，通常为每公升培养基 约加30至1000毫克。如果添加量不到30毫 克/公升培养基，则结果无法提高所培养绿藻的总 脂质含量。另方面，添加量如超过1000毫克/公升 培养基，则显示不出效果有何特殊提高。碳源较佳添 加量为100～600毫克/公升培养基。碳酸氢盐的 例子有碳酸氢钠，碳酸氢钾等，乙酸盐则有乙酸钠，乙 酸钾，乙酸铵等。

依照本发明，与上述碳源同时添加于海水系培养 基的生物素(biotin)，其量无特别规定，但在0.1微 克/公升培养基以下时，则几乎没有效果。生物素 较佳添加量为0.5-10微克。

除上述碳源和生物素外，海水系培养基尚可添加 硫酸铵等氮源，过磷酸钙等磷源。氮源以约100毫 克/公升培养基的比率，而磷源以约10毫克/公 升培养基的比率添加为佳。

培养基的pH值会随培养时间的增加而变化，但 至少在海产绿藻培养开始之前(即海产绿藻接种之 前)的培养基以设定于6至8的pH值为佳。

在本发明中，采用上述培养基时，海产绿藻(例 如chlorella minutissima)最好在15℃至25℃温度 培养。培养温度超出此范围时，生育速度下降，且绿 藻中EPA含量有下降的趋势。培养时间通常为 3～20天。

依照本发明培养海产绿藻时，绿藻接种量无特别 限制，通常是以0-0.5克(湿菌体重量)/公升培 养基的比率接种。

依照本发明的海产绿藻培养方法，可加快生育速 度，保持总脂质中所占的EPA含量高，得以稳定生 产总脂质含量高的海产绿藻，这与选自碳酸氢盐，乙 酸和乙酸盐中至少一种碳源，以及生物素的相乘效 果，据推论系脂肪酸生成第一步骤中，促进丙二醯基 CoA生成的缘故。

此外，利用光合作用的碳源供给方法，已知有将 碳酸气在暴气中混入的方法，本发明与习知方法比 较，碳源的利用较佳，可降低生产成本。

依照本发明培养海绿藻后，将培养绿藻菌体以适 当溶剂，例如己烷和异丙醇之混合溶剂萃取，分离脂 质成分，利用常法卤化分解。除去不卤化成分后，收 集脂肪酸，以尿素附加物法饱和，并除去不饱和单脂 肪酸。如上所得脂肪酸，其EPA含量相当高，如欲 再提高纯度则可利用硅胶柱色谱法。借此柱型色层 分析法分离，纯度可达95％以上。

本发明实例如下：

实施例