[发明专利]一种核酸内切酶及其应用

说明书

本发明提供了一种核酸内切酶突变体，包括：(a)所述核酸内切酶突变体与SEQ ID NO.1所示氨基酸序列相比，含有如下至少一个位点：T43、G67、Q69、W89、Q99、G101、G132、S135、N136、F137、S140、N143、S145、F149、Q152、A154、Q169、N188或G222，经过氨基酸突变且具有核酸内切酶活性功能的蛋白质；或(b)所述核酸内切酶突变体与(a)所示的氨基酸序列经过一个或几个保守氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加具有相同功能的氨基酸序列。本发明得到的核酸内切酶突变体具备耐受更高盐浓度的能力，并且在低温和室温环境中具有较高活性。

技术领域

本发明涉及核酸酶技术领域，尤其涉及一种核酸内切酶及其应用。

背景技术

近年来随着生物技术的发展，越来越多的抗体，重组蛋白，重组蛋白疫苗、病毒载体疫苗、细胞治疗和基因治疗药物等生物制品进入治疗领域，生物制品的质量控制也日趋严格。宿主核酸残留具有多种生物安全风险，过量的宿主核酸残留可能会导致机体感染，致瘤，引发免疫副反应，基因转座和重组等，因此宿主核酸残留成为了生物制品质控的重中之重。我国药典中明确规定酵母和大肠杆菌表达的生物制品中DNA残留量不超过10 ng/剂量。2020年我国药典将人用狂犬病疫苗（Vero细胞）DNA残留标准更新为≤3 ng/剂量。除了残留量的规定，FDA、CDE发布的相关指导文件中建议残留的细胞宿主DNA片段不能超过一个功能基因的长度（约200 bp）。因此在生物制品生产工艺中必须含有去除核酸的步骤并进行检验验证，以确保生物制品中的核酸残留满足相应法规的要求。常用的去除核酸的方法如沉淀法，因为会发生聚集和包裹现象，影响去除效率，在核酸残留要求较高时难以达到标准。为了实现生物制品中核酸残留量的控制，近年来各类核酸酶已被广泛用于生物制品的纯化工艺中并取得了良好的效果。

核酸酶是一种能够将聚核苷酸链的磷酸二酯键切断的酶，核酸酶属于水解酶，作用于磷酸二酯键的P-O位置。不同来源的核酸酶，其专一性、作用方式都有所不同。有些核酸酶只能作用于RNA，称为核糖核酸酶（RNase），有些核酸酶只能作用于DNA，称为脱氧核糖核酸酶（DNase），有些核酸酶专一性较低，既能作用于RNA也能作用于DNA，因此被称为非特异性核酸酶。根据核酸酶作用的位置不同，又可将核酸酶分为核酸外切酶（Exonuclease）和核酸内切酶（Endonuclease）。

目前市面上主流的商业化核酸酶主要为Benzonase (粘质沙雷菌Serratiamarcescens核酸酶)、Omnicleave (Epicentre)或DNA酶I。Benzonase和Omnicleave是全能核酸酶可以消化DNA和RNA，而DNA酶I只能消化DNA。通常情况下，核酸酶在低于100 mM NaCl的条件下具有较高的核酸酶活性，当盐浓度高于100 mM后，酶活性显著降低。核酸酶具有广泛的用途，例如Benzonase 全能核酸酶的主要应用如下：1）病毒疫苗、细胞和基因治疗用病毒载体、溶瘤病毒中核酸的去除；2）去除蛋白质等生物制品中的核酸；3） 降低核酸引起的粘度；4)可加入细胞培养基，防止细胞聚集；5）降低大肠杆菌细胞裂解液的粘度以提高过滤性；6）颗粒(病毒、包涵体等)的预处理；7）ELISA、柱层析、双向电泳和western blot分析的样品制备，核酸酶处理后可提高分辨率和回收率。利用核酸酶可以高效的去除生物制品中的核酸残留，但是目前主流的核酸酶在较高盐浓度下活性高度受抑制甚至失活，无法满足需求。因此，开发一种耐盐的高效的核酸酶对于生物样品中宿主核酸残留的去除具有重要的意义，具有高耐盐性的核酸酶可以更广泛地应用于基因工程，生物大分子生产，特别是核酸药物的生产。市售核酸酶一般为酵母表达或者大肠杆菌上清表达，生产工艺复杂，成本较高。

蛋白质对盐浓度的耐受是多方面因素影响的。其中蛋白表面理化性质的改变会显著影响蛋白质对盐浓度的耐受，蛋白表面变化趋势包括等电点降低、疏水性降低、热容增加、可压缩性降低和柔韧性参数增加等。