[发明专利]用于肝内胆管癌FGFR2基因框内缺失突变的多重荧光定量检测方法和检测试剂盒

说明书

胆管癌（Cholangiocarcinoma,CCA）恶性程度高，治疗方法有限，根据其解剖位置的不同分为肝外胆管癌、肝内胆管癌和肝门部胆管癌；FGFR2基因融合在肝内胆管癌中相对富集，且针对FGFR2基因融合的药物Pemigatinib是少数已经获批的胆管癌靶向治疗的药物之一；除了FGFR2基因融合，近年来的研究发现FGFR2框内缺失突变在肝内胆管癌中也相对富集并且可以作为靶向治疗的位点，但是目前除了二代测序之外并没有关于FGFR2基因的多种荧光定量的检测方法；本发明为了解决二代测序价格昂贵耗时长且判读困难等缺点，特将扩增FGFR2基因框内缺失突变位点包括：FGFR2 p.A97_G103 del，p.H167_N173del，p.P286_K292 del，p.P170_K176del，p.L258_G271del，p.N631_M640del，p.I288_D304 del，p.E489del，p.P263_A266del，p.K545del，p.Q285_D304 del，p.I548Wfs*8，p.V280_K292del的引物探针制备于一个试剂盒中，简单、快捷、价格低廉，适用于在临床检测。

技术领域

本发明属于肿瘤的靶向检测领域，具体涉及用于肝内胆管癌FGFR2基因框内缺失突变的多重荧光定量检测方法，肝内胆管癌的检测试剂盒，和用于扩增FGFR2基因框内缺失突变位点的引物探针，及其在制备诊断肝内胆管癌的检测试剂盒中的应用。

背景技术

胆管癌（Cholangiocarcinoma, CCA）是除了肝细胞癌之外发生率最高的原发性肝脏恶性肿瘤，根据其解剖位置的不同分为肝外胆管癌、肝内胆管癌和肝门部胆管癌。近年来，肝内胆管癌（Intrahepatic cholangiocarcinoma, ICC）的发病率逐年升高，据流行病学预测，在未来的20-30年间，ICC的发病数量将达到现在的10倍之多。但由于ICC发病隐匿，多数患者在初诊时就已经是晚期，丧失了手术机会，而常规的系统性治疗方法对患者获益甚微，因此迫切需要从肝内胆管癌的发病机制出发寻找新的治疗方法和治疗策略。

2020年美国食品药品监督管理局(FDA)批准了FGFR选择性抑制剂Pemigatinib用于治疗携带FGFR2（纤维细胞生长因子受体2）重排的局部晚期或转移性胆管癌患者，该药也于2022年在中国获批上市。作为首个获批应用于胆管癌治疗的靶向药物，Pemigatinib的成功上市开启了靶向治疗胆管癌的新纪元。既往对胆管癌中FGFR2基因变异的研究主要集中在基因融合/重排中。文献报道，FGFR2基因融合主要富集于ICC而鲜少发生于肝外和肝门部胆管癌，且FGFR2融合基因的引入可以诱导正常的小鼠肝脏发生胆管癌，证明FGFR2基因融合/重排是ICC的重要发病机制之一。除了基因融合/重排(fusion/translocation)之外，点突变（site mutation）、基因扩增(amplification)、框内缺失(in-frame deletion)、截断突变(truncated deletion)等多种变异形式都可导致基因的功能性获得，从而将正常的基因转变为驱动性致癌基因。但迄今为止，在ICC中对除了重排之外的FGFR2其它变异体研究甚少。

2022年4月，来自哈佛大学医学院的研究者首次提出发生在FGFR2胞外结构域的短片段框内缺失(Extracellular Domain In-Frame Deletions ，EIDs)也是导致ICC发生的驱动因素。并尝试将口服FGFR选择性抑制剂Debio 1347应用于三名携带FGFR2 EIDs但丧失手术机会的ICC患者，后期的影像学数据证明三名患者在使用了Debio 1347一段时间后均获得了疾病的部分缓解。其中一名患者在口服Debio 1347一段时间后发生了FGFR2 L618F耐药位点的突变，继续使用二代TKI抑制剂futibatinib后又获得了17个月的部分缓解。这一结果证明FGFR2 EIDs的发生不仅在发育过程中会导致一系列的遗传性疾病，同时强调了在肿瘤发生过程中的致癌性驱动作用和应用靶向药物的前景。携带FGFR2 EIDs患者对于FGFR抑制剂良好的反应性大大拓展了胆管癌靶向治疗的应用范围并为临床针对FGFR2ome亚型肿瘤进行靶向治疗提供了依据。