[发明专利]一种miRNA或其检测试剂的用途

说明书

本发明提供了一种miRNA或其检测试剂的用途，属于生物技术领域。具体说，本发明提供了miR‑4466或其检测试剂的用途，用于检测辅助生殖技术中的胚胎发育潜能。本发明实验证明，miR‑4466在发育状态良好的胚胎培养基中明显高表达；通过实时PCR检测胚胎培养基中miR‑4466表达情况可以预测辅助生殖技术中的胚胎发育潜能，为预测胚胎发育潜能提供了一种无创生物标志物。

技术领域

本发明涉及生物技术领域。具体涉及一种通过检测胚胎培养液中miR-4466表达量来鉴定胚胎发育潜能的用途。

背景技术

近年来，辅助生殖技术(ART)的应用逐年增加，但种植率及活产率仍未达到理想水平。胚胎质量是影响移植的关键因素之一，当前，胚胎形态学特征和卵裂率是挑选优质胚胎的主要指征，但仍有许多经过筛选后的优质胚胎无法成功种植或在种植后发生胚胎停育。因此，寻找高特异性、无创、易于获取的胚胎发育潜能标志物对筛选优质胚胎以成功着床及妊娠至关重要。而随着ART的广泛开展，胚胎培养基已成为体外受精胚胎移植后的日常副产品，胚胎培养基为精卵结合及胚胎发育提供了一个微环境，在早期胚胎发育和成熟过程中起着至关重要的作用，同时胚胎培养基中也含有大量胚胎释放的活性物质及代谢物质，是筛选无创生物标志物的首选来源。

研究发现，microRNAs(miRNAs)在胚胎发育过程中起到至关重要的作用。已有研究表明，一些miRNAs参与不同物种胚胎发育，如研究发现胚胎着床前miRNA-29b的抑制会导致早期胚胎发育的停滞，这种结果可能是由多种基因下调所致，miRNA-29b可能通过调控多种靶基因而对胚胎发育发挥作用。miRNA-21对于移植前胚胎具有抗凋亡作用，具体机制可能于IL-6诱导的Stat3信号通路通过增加细胞数量和抑制凋亡来提高体外胚胎的存活率。还有研究者在牛和人胚胎培养基中检测到miRNA-25，其表达影响基因wwp2和fbxw7的调控，从而参与调节细胞的重新编程以促进诱导多能干细胞，miRNA-25过表达还可促进细胞增殖，而其下调则促进细胞凋亡和氧化应激。miRNA-320参与调控多种信号通路，包括Wnt信号通路，而Wnt信号通路参与受精过程中细胞膜的黏附和融合、调控细胞增殖、细胞粘附、多能性和极性的建立，在胚胎着床前发育和卵泡发育中起重要作用。近年相关发明专利陆续也有申请和授权，如MiR-125a-5p在胚胎早期发育中的应用(CN 113061661 B)；与冷冻精子质量或其所形成胚胎发育相关microRNA标志物及其应用(CN 114369668 A)，该申请保护的冷冻精子质量或胚胎发育相关的microRNA标志物为miR-30b-5p、miR-148b-3p和miR-140-5p中的一种或多种。通过检测冷冻精子中3个靶标microRNA的表达，用于预测冷冻精子样本的质量及其在后续所形成胚胎的发育潜能；通过检测miR-290家族表达鉴定胚胎发育潜能的方法(CN 115323059 A)。总之，microRNAs做为胚胎发育过程中诊断或治疗的靶点，越来越受到重视。但做为无创标记物，在临床辅助生殖技术中的应用，较少报道。

本专利中我们收集了不同发育潜能的人类胚胎培养液(已经伦理审查批准)，经提取microRNAs后高通量测序发现了一些差异表达的miRNAs，后经实时PCR验证我们发现miR-4466是其中差异最为明显的一种，而经文献查询miR-4466在口腔鳞癌、胃癌、注意缺陷多动障碍患儿血清、缺氧诱导下人肺动脉内皮细胞中有差异表达，其他情况没有报导，可以成为预测胚胎质量的无创新型生物标志物，用以检测胚胎发育潜能。

发明内容

发明目的：

本发明的目的是公开一种miR-4466或其检测试剂的用途，可用于无创性检测胚胎发育潜能，作为辅助生殖技术中筛选优质胚胎的依据。

技术方案：

所述胚胎发育潜能检测阶段为卵裂期，通常为受精卵培养第3天。

具体检测包括以下步骤：收集卵裂期胚胎的培养基，对应胚胎可冻存或更换新培养基，提取培养基中的总miRNA，将总miRNA反转录为cDNA，实时PCR技术检测miR-4466表达量。