[发明专利]一种膜结合L-氨基酸脱氨酶突变体及其应用

说明书

本发明公开了一种膜结合L‑氨基酸脱氨酶突变体及其应用。所述膜结合L‑氨基酸脱氨酶突变体由奇异变形杆菌来源的野生型PM1酶经过突变所得，野生型PM1酶的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，突变方式为以下任意一种：(1)G259W；(2)D340N。本发明PM1酶突变体由奇异变形杆菌(Proteus mirabilis)来源的野生型PM1酶经过突变所得，其中G259W和D340N两种突变体全细胞催化L一苯丙氨酸转化数相对于WT提高了1.3倍和1.2倍。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种膜结合L-氨基酸脱氨酶突变体及其应用。

背景技术

α-苯丙酮酸(3-Phenylpyruvic acid，PPA)，是苯丙氨酸在生物体内重要的代谢中间产物，其被广泛应用于制药、食品、化工行业中，是生物法制备D-型苯丙氨酸的关键性前体物质，也是制备手性药物及常用食品甜味剂天冬甜二肽(阿斯巴甜)的前体物质。另外，苯丙酮酸也可以通过加氢还原得到天然抗菌物质苯乳酸(3-Phenyllactic acid，PLA)。

目前PPA的化学合成方法主要有α-乙酰氨基肉桂酸水解法、海因法、双羰基化法和氨基酸生物转化法。利用化学合成法合成PPA得率低、易产生有毒有害产物。

微生物发酵主要靠菌体内自身的代谢合成PPA，由于菌体内代谢合成PPA的路径较长且酶活不高，耗时长、产量和合成效率较低，不利于工业化生产。

相比之下，以价格低廉的L-苯丙氨酸为原料，利用生物转化法制备PPA具有反应条件温和、绿色环保的特点。

目前，能够生物转化合成α-酮酸的主要酶类有：氨基酸转氨酶(Aminotransferase，AT)、氨基酸脱氢酶(Amino acid dehydrogenases，ADH)、L-氨基酸氧化酶(L-amino acid oxidase，L-AAO)和膜联L-氨基酸脱氨酶(membrane bound L-aminoacid deaminase，mL-AAD)。

在上述4种酶中，AT催化的是可逆反应，需要另外添加辅酶因子磷酸吡哆醛(PLP)，并需要另一种α-酮酸作为氨基受体，导致成本较高，不适合工业化生产。

相似地，ADH也催化可逆反应，且反应需要辅酶因子NADP⁺，但出于成本考虑，常选择添加辅酶再生体系(添加NADPH氧化酶)，但NADPH氧化酶与ADH的最适pH相差较大，NADPH氧化酶的最适pH为6.0～7.5，而ADH催化的最适pH大于10，因此，两者都无法在最适pH下工作，导致催化效率不高，不适合工业化生产。

L-AAO和mL-AAD的催化反应都属于不可逆反应，转化率都比较高，但是，L-AAO催化产α-酮酸时，会有副产物NH₃和H₂O₂产生，而大量的H₂O₂不仅对细胞有毒害作用，影响L-AAO活性，还会降解生成的α-酮酸，故常用在体系内添加过氧化氢酶来消化H₂O₂，所以成本有所提高。而mL-AAD在催化时不需要添加辅酶因子、额外氨基受体，也不会产生H₂O₂，对产物无降解作用，也更容易异源表达。因此，mL-AAD是制备PPA的首先用酶。为此，提高mL-AAD对L-苯丙氨酸催化活力对于利用生物法制备PPA具有重要现实意义。

发明内容

本发明提供了来源于Proteus mirabilis mL-AAD(PM1)酶的两种突变体，这两种酶具有高于野生型PM1的酶活力，能更高效催化合成α-苯丙酮酸。

本发明首先提供了一种膜结合L-氨基酸脱氨酶突变体，由奇异变形杆菌(Proteusmirabilis)来源的野生型PM1酶经过突变所得，野生型PM1酶的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，突变方式为以下任意一种：