[发明专利]一种短柄镰刀菌的PCR检测方法及其应用

说明书

本发明公开了一种短柄镰刀菌的PCR检测方法及其应用，属于生物检测鉴定技术领域。该PCR检测方法中使用的引物组包括上游引物和下游引物；所述上游引物的序列如SEQ ID NO.1所示；所述下游引物的序列如SEQ ID NO.2所示。本发明PCR检测方法具备很好的特异性，从23个测试菌株中仅能扩增出短柄镰刀菌，并且可以对低至10pg/μL的病原菌基因组DNA进行检测。因此，本发明所设计的引物和检测方法可以快速、特异、灵敏性鉴定短柄镰刀菌。

技术领域

本发明属于生物检测鉴定技术领域，尤其涉及一种短柄镰刀菌的PCR检测方法及其应用。

背景技术

番茄在我国各地区种植广泛，随着种植面积逐渐扩大，复种指数连年提高，土传病害的发生与危害亦呈逐年加重的趋势。常见的番茄土传病害包括青枯病、枯萎病、根腐病、黄萎病、褐色根腐病和立枯病等，其优势病原菌分别为茄科劳尔氏菌(Ralstoniasolanacearum)、尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)、腐皮镰刀菌(Fusarium solani)、大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)、番茄棘壳孢(Pyrenochaeta lycopersici)和立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)，给我国各地茄科类作物产区造成了严重的经济损失。近期，在番茄土传病害的调查中，对短柄镰刀菌在中国引起番茄枯萎症状病害进行首次报道（Jun Liu,Yi Si Deng, Wei Chang, and Hua Wang. 2023. First report of tomato wilt causedby Fusarium brachygibbosum in China. https://doi.org/10.1094/PDIS-01-23-0076-PDN)。该病菌对番茄种植可能会构成严重威胁，并有可能给番茄产业造成巨大的经济损失。因此，该病原菌的快速鉴定将有助于研究有效的病害管理策略，防止番茄严重减产。然而，短柄镰刀菌的PCR分子快速检测研究还未见报道。

随着分子生物学技术的快速发展，许多基于分子生物学的病原菌分子检测方法相继被开发。与传统的基于分离培养与形态观察的检测方法相比，病原菌的分子鉴定方法准确、高效。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种用于短柄镰刀菌PCR检测的引物组，所述引物组包括上游引物和下游引物；所述上游引物的序列如SEQ ID NO.1所示；所述下游引物的序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明的目的之二在于提供一种检测短柄镰刀菌的试剂，所述试剂含有上述引物组SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2。

本发明的目的之三在于提供一种检测短柄镰刀菌的试剂盒，所述试剂盒中含有上述引物组SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2或上述试剂。

本发明的目的之四在于提供一种短柄镰刀菌的PCR鉴定方法，所述鉴定方法以样品总DNA为模板，利用上述引物组SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2进行PCR扩增，反应结束后根据琼脂糖凝胶电泳判定结果。

优选地，PCR的反应程序为：94℃预变性5min；进入循环，94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环；最后延伸72℃10min。

更优选地，PCR反应体系总体积25ul，其中包括：2.5μL 10×PCR缓冲液，1.5μL25mM Mg²⁺，2μL 10mM dNTP，0.125ul 5U/μL Taq DNA聚合酶，浓度为10μM的上游引物SEQ IDNO.1 1μL，浓度为10μM的下游引物SEQ ID NO.2 1μL，DNA模板1μL，ddH₂O 15.875μL。

更优选地，所述DNA模板提取自番茄。

本发明的目的之五在于提供上述引物组SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2或上述试剂或上述试剂盒在鉴定短柄镰刀菌中的应用。