[发明专利]一种mRNA-LNP中提取游离mRNA的方法及其包封率的测定方法

权利要求书

1.一种mRNA-LNP中提取游离mRNA的方法，其特征在于，包括采用羧酸磁珠从含mRNA-LNP体系中提取游离mRNA的步骤。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，将mRNA-LNP体系与羧基磁珠于800-1200rpm振摇下作用20-60分钟。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，将mRNA-LNP体系与羧基磁珠于1000rpm振摇下作用30分钟。

4.如权利要求2所述的方法，其特征在于，测定前羧基磁珠的处理：充分混匀磁珠，置于磁力架上至溶液完全透明，移去上清液；更具体地，采用涡旋并置于滚轴混匀仪上室温滚动混匀，吸取磁珠浓度5-15mg/ml混匀状态下的磁珠溶液至无酶离心管中；离心管置于磁力架上至溶液完全透明，移去上清液。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，游离mRNA的提取步骤：在移去了上清液的磁珠中，加入mRNA-LNP溶液，充分混匀；加入RNA结合缓冲液，轻柔吸打混匀；置于加热振荡器上，室温旋转孵育；置于磁力架上至溶液清澈透明，移去上清液；加入DEPC水配制的乙醇溶液，涡旋混匀磁珠；置于磁力架上至溶液清澈透明，移去上清液后，进行干燥；移去磁力架，加入DEPC水，涡旋混匀磁珠并置于振荡器上室温孵育；涡旋并置于磁力架上直至溶液清澈透明；收集含游离mRNA的上清液；

更优选地，置于振荡器上室温孵育是指置于振荡器上室温800-1200rpm孵育3-10min。

6.如权利要求1至5任一项所述的方法，其特征在于，还包括进一步测定最后得到上清液中的mRNA浓度的步骤；优选地，采用HPLC的方法进行测定。

7.如权利要求6所述方法，其特征在于，采用DNAPac^TMRP色谱柱，流动相A为六氟异丙醇、三乙胺的水溶液；流动相B为六氟异丙醇、三乙胺的甲醇溶液；

更具体地，流动相A配制：取六氟异丙醇21.06ml，三乙胺1.04ml，加水477.9ml，混匀；流动相B配制：取六氟异丙醇21.06ml，三乙胺1.04ml，加甲醇477.9ml，混匀。

8.如权利要求6所述方法，其特征在于，流速为0.4ml/min，检测波长为260nm，柱温为75℃，样品室温度为8℃，洗针溶剂为50％甲醇。

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，洗脱程序如下：

10.一种测定mRNA-LNP的包封率的方法，其特征在于，通过如权利要求1至9任一项所述的方法提取制备的mRNA-LNP中的游离mRNA，并测定其含量，结合mRNA-LNP中总mRNA的含量来计算得到mRNA-LNP的包封率；

具体地，包封率计算方法如下：

游离mRNA浓度：

总mRNA浓度：

包封率：EE％＝(V_t-C_f)/C_t；

其中：

C_t为样品溶液中总mRNA的浓度，μg/ml；

C_f为样品溶液中游离mRNA的浓度，μg/ml；

A_t为样品溶液中总mRNA色谱峰的峰面积；

A_f为样品溶液中游离mRNA色谱峰的峰面积；

A_std为对照溶液中mRNA色谱峰的峰面积；

C_std为对照溶液中mRNA的浓度，μg/ml；

W为样品稀释倍数；

优选地，检测样品中总mRNA时，样品处理如下：取mRNA-LNP样品25μL至无酶离心管中，加入25μL DEPC水和50μL 2.5％的triton X-100，混匀后进液相测试。