[发明专利]一种截短内含子、包含其的HAO1基因及应用

说明书

本发明公开了一种截短内含子、包含其的HAO1基因及应用。本发明对人HAO1基因内含子进行了截短改造，获得了包含上述截短内含子的HAO1基因，同时通过验证表明，其满足不影响HAO1基因表达的要求，为后续构建人源化HAO1动物模型提供了基础，同时也为改造其他人源基因的内含子提供了借鉴。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，涉及一种截短内含子、包含其的HAO1基因及应用。

背景技术

实验动物疾病模型对于研究人类疾病发生的病因、发病机制、开发药物是不可缺少的研究工具。但由于动物与人类的生理结构、代谢系统、基因组位置和序列的差异，传统的动物模型并不能很好的反映疾病在人体的真实表型和状况，因此，在动物体内建立更接近人类生理特征的疾病模型是科学研究疾病发生发展治疗的迫切需求。

随着基因工程技术的不断发展和成熟，通过将人类基因替代或置换动物的同源基因的方法开发人源化动物模型的策略已经实现。尤其是基因编辑技术的快速发展，将人源基因正常或突变的基因序列替换动物基因组的同源基因序列，可以建立更接近人类生理或疾病特征的正常或突变基因动物模型。在基因编辑技术应用于治疗疾病的时代，基因人源化动物模型对于临床前的药物研发是至关重要的。

在构建基因人源化小鼠模型中最常用的方法是将人源基因的CDS编码区(Codingsequence)显微注射到小鼠受精卵中，获得人源化基因小鼠。然而如前面所述，仅将CDS基因注射到小鼠受精卵后，所得到的相关人源化基因并不与人类基因情况相同。但当同时需要人源基因的内含子时，由于内含子序列通常序列很长，全长基因的显微注射存在难度高，风险高，成功率低，周期长等诸多限制条件。

原发性高草酸尿症是一种罕见的常染色体隐性遗传的代谢疾病，由于患病个体缺乏阻止草酸盐积累的特定酶的功能水平，使得草酸盐在肾脏和身体其他器官系统中积累。目前主要的治疗手段是肝肾联合移植，但器官来源短缺和巨额医疗费用限制多数病人无法得到有效医治。目前FDA批准的药物Oxlumo是一种针对HAO1基因的siRNA药物，可通过抑制乙醛酸形成来减少草酸从而治疗疾病。由于siRNA干扰药物需要重复给药，因此希望通过CRISPR/Cas9基因编辑技术开发一种新的治疗方法，这其中不可缺少的就是动物模型的选择。鉴于人和小鼠基因的差异性，小鼠来源的动物模型将较难满足实验需求，因此迫切需要构建HAO1基因人源化的原发性高草酸尿症的小鼠模型，然而hHAO1基因全长58kb，构建一个HAO1基因全长的人源化小鼠难度高，风险高，成功率低，而只保留CDS编码区较难满足完全贴近人类基因的实际情况，对内含子进行截短又容易影响hHAO1基因的正常剪接和转录表达。

综上所述，对人HAO1(hHAO1)基因的内含子进行改造，设计在完整CDS编码区中含有内含子的hHAO1基因，同时不影响hHAO1基因的正常剪接和转录表达是目前亟需要解决的问题之一。

发明内容

针对现有技术的不足和实际和需求，本发明提供一种截短内含子、包含其的HAO1基因及应用，对人HAO1(hHAO1)基因的内含子进行改造，建立在完整CDS编码区中含有一段显著截短内含子的hHAO1基因，同时不影响hHAO1基因的正常剪接和转录表达，可有效应用于构建人源化模型。

为达上述目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供一种截短内含子，所述内含子的核酸序列包括以下中任意一种：

(1)人HAO1基因中第三内含子靠近第三外显子的50-200bp序列和靠近第四外显子的50-200bp序列连接组成的序列；

(2)人HAO1基因中第二内含子靠近第二外显子的50-200bp序列和靠近第三外显子的50-200bp序列连接组成的序列。