[发明专利]一种病毒载体与人肿瘤抑制基因的重组体

说明书

本发明涉及基因工程技术领域，并公开了一种病毒载体与人肿瘤抑制基因的重组体，所述重组体的构建方法具体包括如下步骤，取带有6个his标签的人端粒酶C端第925‑1121片段的编码序列，经双酶切、连接反应克隆至含有绿色荧光蛋白基因GFP的穿梭质粒中，得到重组穿梭质粒，将得到的重组穿梭质粒进行Pme酶切线性化，通过与骨架质粒在BJ5128细菌中进行同源重组，得到重组腺病毒质粒，将得到的重组腺病毒质粒转染HEK293细胞进行重组包装，收集具有绿色荧光的细胞，得到细胞包装的重组腺病毒，将得到的重组腺病毒采用氯化铯梯度离心法进行纯化，得到重组腺病毒载体，将得到的重组腺病毒载体与p53混合，在20‑50℃下孵育30‑50min，通过静电复合得到携带P53基因的重组腺病毒复合物。

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，更具体地说，涉及一种病毒载体与人肿瘤抑制基因的重组体。

背景技术

随着分子生物学技术的进步，特别是基因工程技术的发展，恶性肿瘤的基因治疗成为人们研究的热点，目前，全球共有600多项基因治疗方案获准进入临床试验，有些治疗方案已获得了一定的疗效，初步显示了基因治疗的前景，作为可用于基因治疗的各种载体，本身不具有任何治疗疾病的意义、无临床应用价值；而作为可用于各种治疗目的基因，由于导入靶细胞及在靶细胞内表达的难度，只具有潜在的治疗作用，而不具备实用的临床价值，只有将具有潜在治疗作用的基因与可转移基因的载体结合，通过后者介导，将目的基因导入靶细胞并表达，才能达到真正的临床治疗效果，因此，构建治疗基因与基因载体的融合序列是实现基因治疗的关键，将目的基因的表达盒与载体进行融合常用的方法是在真核细胞中进行同源重组，过程复杂，费时费力，而使用在原核细胞(大肠杆菌)中实现同源重组、构建融合表达载体的新技术则可有效解决上述问题。

缺乏特异性、靶向性及高效性的基因转移载体一直是肿瘤基因治疗的一个难题，目前，用于基因治疗研究的载体主要分为病毒载体和非病毒载体两大类，常用的病毒载体有腺病毒载体、腺相关病毒载体和逆转录病毒载体等，腺病毒载体是常用的基因载体，它的优点在于转染效率高、可操作性好、能携带较大的目的基因片段、可制备高效价的病毒颗粒，易于工业化生产，既能感染分裂期细胞也可感染非分裂期细胞，具有安全、致病性低等优点，但也存在不足之处，一是感染缺乏特异性，二是具有免疫原性，为此，本申请提出了一种病毒载体与人肿瘤抑制基因的重组体。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种病毒载体与人肿瘤抑制基因的重组体。

本发明的上述技术目的是通过以下技术方案得以实现的：一种病毒载体与人肿瘤抑制基因的重组体，所述重组体由DNA克隆技术构建的腺病毒载体与人肿瘤抑制基因p53表达盒相结合，能在基因工程改造过的特定细胞中扩增繁殖，也能在真核细胞中表达肿瘤抑制蛋白p53的融合序列，所述重组体的构建方法具体包括如下步骤，步骤S1，取带有6个his标签的人端粒酶C端第925-1121片段的编码序列，经双酶切、连接反应克隆至含有绿色荧光蛋白基因GFP的穿梭质粒中，得到重组穿梭质粒，步骤S2，将得到的重组穿梭质粒进行Pme酶切线性化，通过与骨架质粒在BJ5128细菌中进行同源重组，得到重组腺病毒质粒，步骤S3，将得到的重组腺病毒质粒转染HEK293细胞进行重组包装，收集具有绿色荧光的细胞，得到细胞包装的重组腺病毒，步骤S4，将得到的重组腺病毒采用氯化铯梯度离心法进行纯化，得到重组腺病毒载体，步骤S5，将得到的重组腺病毒载体与p53混合，在20-50℃下孵育30-50min，通过静电复合得到携带P53基因的重组腺病毒复合物。

作为优选的，所述重组体在任何原核细胞中以同源重组的方式获得。

作为优选的，所述的重组体用于制备进行静脉注射、动脉注射、瘤内注射、肌肉注射、皮下注射、器官注射和胸、腹水内注射的药物。

作为优选的，所述步骤S4的重组腺病毒载体，其中肿瘤细胞选取人子宫颈癌肿瘤细胞系，正常细胞选取人脐静脉内皮细胞。

作为优选的，所述人脐静脉内皮细胞是原代细胞。