[发明专利]一种假拟盘多毛孢属真菌原生质体的制备方法及遗传转化体系的构建方法

权利要求书

1.一种假拟盘多毛孢属真菌原生质体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

将假拟盘多毛孢属真菌菌丝与酶解液混合，得到裂解液；

将所述裂解液培养4～7h，得到原生质体液，所述原生质体液中包括假拟盘多毛孢属真菌原生质体。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述假拟盘多毛孢属真菌原生质体在所述原生质体液中的浓度为(4.9～5.9)×10⁶个/mL。

3.根据权利要求1～2任一项所述的制备方法，其特征在于，所述假拟盘多毛孢属真菌包括Pseudopestalotiopsis camelliae-sinensis P-1-1菌株。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述假拟盘多毛孢属真菌菌丝的制备方法包括：

将活化的假拟盘多毛孢属真菌菌株接种至PDB培养基中进行培养，得到菌丝球；所述PDB培养的震荡频率为150～200rpm，温度为25～28℃，时间为28～32h。

将所述菌丝球进行研磨后接种至M3S培养基中进行菌丝培养，得到假拟盘多毛孢属真菌幼嫩菌丝；所述M3S培养的震荡频率为150～200rpm，温度为25～28℃，时间为12～15h。

5.权利要求1～4任一项所述的制备方法在构建假拟盘多毛孢属真菌遗传转化体系中的应用。

6.一种假拟盘多毛孢属真菌遗传转化体系的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

采用权利要求1～4任一项所述的制备方法制备得到假拟盘多毛孢属真菌原生质体；

将所述假拟盘多毛孢属真菌原生质体与STC溶液混合，得到假拟盘多毛孢属真菌原生质体悬浮液；

将所述假拟盘多毛孢属真菌原生质体悬浮液、含有抗生素标记基因和目的基因的质粒、肝素钠溶液混合，0～4℃静置30min，得到第一原生质体溶液；

向所述第一原生质体溶液中加入SPTC溶液，0～4℃静置30min，得到第二原生质体溶液；

将所述第二原生质体溶液悬浮于再生培养基中复苏，得到复苏的原生质体溶液；

将所述复苏的原生质体溶液与选择性培养基混合，黑暗培养3～5d，得到假拟盘多毛孢属真菌转化子。

7.根据权利要求6所述的构建方法，其特征在于，所述假拟盘多毛孢属真菌原生质体悬浮液的体积、含有抗生素标记基因和目的基因的质粒的质量和肝素钠溶液的体积的比值为50μL：2μg：1μL；所述假拟盘多毛孢属真菌原生质体悬浮液中假拟盘多毛孢属真菌原生质体的浓度为(9.8～11.8)×10⁴个/μL；所述肝素钠溶液的浓度为0.1g/mL。

8.根据权利要求6所述的构建方法，其特征在于，所述再生培养基以水为溶剂，包括：酵母粉1wt.％，酪蛋氨基酸1wt.％和蔗糖274wt.％；pH值为7.0；

所述选择性培养基以水为溶剂，包括：马铃薯汁20wt.％，葡萄糖2wt.％，琼脂1.5wt.％和与所述抗生素标记基因对应的抗生素。

9.根据权利要求6或8所述的构建方法，其特征在于，所述抗生素标记基因包括潮霉素B抗性表达基因。