[发明专利]一种里氏木霉CBHІ信号肽突变体及其在促进异源蛋白高效表达分泌中的应用

说明书

本发明涉及一种里氏木霉CBHI信号肽突变体及其在促进异源蛋白高效表达分泌中的应用。其中里氏木霉CBHI信号肽突变体SPM1的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明以里氏木霉CBHI信号肽为基础，在其第四位赖氨酸之后增加两个亮氨酸，得到里氏木霉CBHI信号肽突变体SPM1。该突变体增强了对异源蛋白的引导能力，能够有效促进异源蛋白XynST11的表达分泌。在异源蛋白XynST11的表达分泌过程中引入里氏木霉CBHI信号肽突变体SPM1后，胞外培养基中XynST11的分泌量和发酵液中由XynST11产生的木聚糖酶酶活水平均有大幅度提高，达到了25U/mL，远远高于CBHI信号肽，因而里氏木霉CBHI信号肽突变体SPM1在促进异源蛋白表达分泌，制备木聚糖酶中具有很大的应用价值。

技术领域

本发明涉及一种里氏木霉CBHI信号肽突变体及其在促进异源蛋白高效表达分泌中的应用，属于生物工程技术领域。

背景技术

木质纤维素物质是生物质资源的主要成分，其开发利用对我国经济发展、环境保护等社会核心问题具有重要的战略意义。丝状真菌里氏木霉是自然界中高效降解纤维素的杰出代表。里氏木霉具有强大的纤维素酶合成分泌能力，胞外纤维素酶系中外切酶CBHI的含量极高，占到了分泌蛋白总量的60％以上。由于里氏木霉具有高效的蛋白合成分泌能力及高安全性、可利用廉价原材料等诸多优势，也被开发作为底盘细胞用于异源蛋白的表达分泌。

蛋白质的分泌生产有利于目标蛋白产品的下游纯化及生产规模的有效放大。在真核生物的蛋白质表达分泌过程中，蛋白N端的信号肽序列发挥着必不可少的重要作用。信号肽介导新生分泌蛋白顺利进入内质网，即完成内质网易位，新生分泌蛋白才能够在内质网中完成折叠与加工修饰，并进入后续运输环节。因此，高效的信号肽序列能够有效促进分泌蛋白的生产水平。由于CBHI是里氏木霉中分泌水平最高的内源蛋白，所以目前常以CBHI的高效信号肽序列(N端17个氨基酸)引导异源蛋白的分泌合成。但是时常会遇到异源重组蛋白分泌生产水平较低的问题，因此需要在CBHI的高效信号肽序列基础上，开发更为高效的突变体序列形式，以进一步促进异源蛋白的高效分泌生产，推动里氏木霉底盘细胞的发展升级，而目前尚未有相应技术。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种里氏木霉CBHI信号肽突变体及其在促进异源蛋白高效表达分泌中的应用。

本发明技术方案如下：

一种里氏木霉CBHI信号肽突变体SPM1，其氨基酸序列相对于里氏木霉CBHI信号肽的氨基酸序列仅存在下述突变：在第四位赖氨酸之后增加两个亮氨酸；

所述里氏木霉CBHI信号肽的氨基酸序列为：MYRKLAVISAFLATARA。

根据本发明优选的，所述里氏木霉CBHI信号肽突变体SPM1的氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示。

根据本发明优选的，所述里氏木霉CBHI信号肽突变体SPM1的核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示。

本发明的第二个方面，提供含有所述里氏木霉CBHI信号肽突变体SPM1的编码基因的表达盒、重组载体。所述重组载体对出发载体并没有特别的限制，可为本领域中已知的任何载体，只要它能够在宿主中进行复制即可。例如，所述载体包括但不限于质粒，噬菌体。一旦转化入合适的宿主之后，所述载体可以复制并独立于宿主基因组发挥功能，或者在某些情况下整合入基因组本身。

根据本发明优选的，所述重组载体是将里氏木霉CBHI信号肽突变体SPM1的编码基因与表达载体连接后获得，所述所述表达载体为质粒。

进一步优选的，所述质粒为pUC19-Ptcu1-pyr4site。