[发明专利]一种指压式无扩增核酸检测微流控芯片及其检测方法

说明书

本发明涉及一种指压式无扩增核酸检测的微流控芯片，包括流道层、薄膜层和指压层，流道层包含检测腔室、样本储液池、反应液储液池、蛇形流道、气阀，其中反应液储液池中包含基于CRISPR‑cas13a的无扩增反应体系，样本储液池主要用于样本储存，蛇形流道用于两种液体流经并流入检测腔室；指压层包含样本液按钮和反应液按钮，按压时通过相应的微泵从储液池内泵送出液体，实现驱动液体定量流动。该芯片可以广泛用于核酸分子快速诊断领域，降低检测成本，简化人为操作进而提高检测效率。

技术领域

本发明涉及微流控技术以及分子诊断领域，具体属于一种指压式无扩增核酸检测微流控芯片及其检测方法。

技术背景

传统核酸检测的过程，第一步是样本采集以及核酸纯化。样本可以是血液、尿液、唾液等体液，采集后需进行预处理裂解细胞使得细胞破碎，释放出细胞膜、蛋白质、多糖、DNA、RNA等物质。而细胞膜、蛋白质等物质会对后续的扩增有一定的影响，需要通过一些手段如磁珠法、浓盐法等去除杂质纯化核酸。第二步是核酸扩增，该过程中最常用的技术即是聚合酶链反应(PCR)，通过解链、退火、延伸三步增多特定目的片段，放大检测信号。扩增之后使用荧光检测、比色或者浊度检测等方法进行核酸检测。

以上过程较为复杂，用时较长，并且在核酸检测过程需要专业人员进行复杂的操作。对于一些偏远及基层医院环境设备较为局限的地区，使用传统的核酸检测方式较为困难，检测效率亟待提高。而微流控技术是将化学生物等一些流体实验集中缩小至微米尺度中操作的一种技术。近年来，微流控技术融合多个领域快速发展，并得到广泛的应用。

基于CRISPR的核酸检测，如SHERLOCK和DETECTR，作为快速和敏感的方法，最近一直吸引着人们的热切关注。这些基于CRISPR的方法包括目标核酸的预扩增过程和随后由CRISPR-Cas酶介导的检测，如Cas12a或Cas13a通过荧光或比色读出。然而，预扩增过程增加了检测时间(至少几十分钟)，并可能由于扩增错误而造成假阴性或假阳性结果。目前已有用于核酸检测的微流控芯片，中国专利“申请号：202210955530.6”提出了一种集等温扩增和CRISPR-cas系统一体的用于核酸检测的微流控芯片及检测方法，该种方式需要外源提供离心力，无法实现便携，且需要对样本进行预扩增，步骤较为繁琐。中国专利“申请号：202011131328.9”提出一种指压式的用于核酸检测的微流控芯片，该芯片核酸纯化步骤复杂，且扩增需要外源提供65℃高温，不利用制备成便携的检测设备。为克服这些挑战，本发明将CRISPR-Cas13的核酸检测系统和微流控芯片结合，开发了一种无扩增的检测方法。

发明内容

本发明基于微流控技术开发了一款指压式无扩增的核酸检测微流控芯片

本发明的目的通过以下技术方案来实现：

一种指压式无扩增核酸检测微流控芯片，其特征在于，所述芯片结构包括流道层、薄膜层和指压层；所述芯片采用层压的技术进行封合；所述芯片是基于CRISPR-cas13a系统的无扩增荧光检测方法进行核酸检测。

根据权利要求1所述的指压式无扩增核酸检测微流控芯片，其特征在于，所述芯片包含检测腔室、样本储液池、反应液储液池、蛇形流道、气阀；其中，反应液储液池中含有基于CRISPR-cas13a的无扩增反应体系，该无扩增反应体系包含无引物复水缓冲液、转录优化5X缓冲液、rNTP、T7聚合酶、Rnase抑制剂、荧光Reporter、CrRNA以及CRISPR-Cas13a溶液。

权利要求2所述的检测腔室，其特征在于，样本液与CRISPR-cas13a无扩增反应体系在检测腔室中混合，完成检测；所述腔室的温度通过接触外部的恒温控制板来维持37℃的反应条件，通过将芯片置于荧光检测平台中，实时检测荧光强度的变化来反映循环扩增情况。