[发明专利]特异性结合绵羊肺炎支原体pdhD重组蛋白的单克隆抗体及应用

权利要求书

1.一种MopdhD重组蛋白，其特征在于，MopdhD重组蛋白的制备方法包括：在NCBI上获取MopdhD基因序列，以pET-28a质粒作为表达载体，以大肠杆菌BL21(DE3)作为表达菌，用0.1mMIPTG诱导目的蛋白表达；然后超声波破碎菌体，离心，取上清，得到可溶性表达的pdhD重组蛋白；利用Ni-NTA Agarose柱进行纯化，得到纯化的pdhD重组蛋白。

2.如权利要求1所述的MopdhD重组蛋白，其特征在于，MopdhD基因序列登录号为JFAD01000018.1，MopdhD基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:1；将SEQ ID NO:1中的TGA突变为TGG，优化密码子序列，得到S2，S2基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:2。

3.一种实施如权利要求1～2任意一项所述的MopdhD重组蛋白筛选得到的分泌特异性结合MopdhD重组蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞株Mo-F2。

4.如权利要求3所述的分泌特异性结合MopdhD重组蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞株Mo-F2，其特征在于，以及该细胞株分泌特异性结合MopdhD重组蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞株的筛选方法包括：

将MopdhD重组蛋白与弗氏完全佐剂按照1:1的体积比混合，进行第一次小鼠免疫；每间隔2周进行一次免疫，MopdhD重组蛋白与弗氏不完全佐剂的体积比为1:1；共免疫4次，抗原剂量均为100μg/只/次；第4次免疫后2周获取小鼠血清，用MopdhD重组蛋白作为抗原，间接ELISA检测小鼠血清的效价，以P/N≥2.1判定为阳性，效价达到1:50000以上免疫合格；获取免疫合格的小鼠的脾细胞，并与SP2/0骨髓瘤细胞融合，融合比例为5:1；筛选融合成功的杂交瘤细胞株，并筛选分泌特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株。

5.如权利要求3所述的分泌特异性结合MopdhD重组蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞株Mo-F2，其特征在于，分泌特异性结合MopdhD重组蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞株于2023年3月15日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO:C202332。

6.一种实施如权利要求3～5任意一项所述的分泌特异性结合MopdhD重组蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞株分泌得到的特异性结合MopdhD重组蛋白的单克隆抗体。

7.如权利要求6所述的特异性结合MopdhD重组蛋白的单克隆抗体，其特征在于，特异性结合MopdhD重组蛋白的单克隆抗体与MopdhD蛋白特异性结合，并与Mo阳性血清竞争性结合pdhD蛋白。

8.如权利要求6所述的特异性结合MopdhD重组蛋白的单克隆抗体，其特征在于，特异性结合MopdhD重组蛋白的单克隆抗体制备方法包括：将杂交瘤细胞株CCTCCNO:C202332腹腔注射BALB/c雌性小鼠，获取BALB/c雌性小鼠腹水，离心，收集中间层淡黄色腹水，纯化后获得与MopdhD特异性结合的单克隆抗体。

9.一种检测Mo血清抗体的竞争ELISA试剂盒，其特征在于，检测Mo血清抗体的竞争ELISA试剂盒以权利要求1～2任意一项所述的MopdhD重组蛋白为抗原、以权利要求6～8任意一项所述的分泌特异性结合MopdhD重组蛋白的单克隆抗体为竞争抗体制备而成。

10.如权利要求9所述的检测Mo血清抗体的竞争ELISA试剂盒，其特征在于，检测Mo血清抗体的竞争ELISA试剂盒包括：

(1)包被MopdhD重组蛋白酶标板2块，96孔/块，4℃保存；

(2)25倍PBST浓缩液1瓶，60mL/瓶；

(3)标准阳性血清1管，0.6mL/管，4℃保存；

(4)标准阴性血清1管，0.6mL/管，4℃保存；

(5)鼠单克隆抗体工作液1瓶，12mL/瓶，4℃保存；

(6)HRP标记羊抗鼠二抗工作液1瓶，25mL/瓶，4℃保存；

(7)TMB底物显色液1瓶，25mL/瓶，4℃保存；

(8)终止液1瓶，15mL/瓶，4℃保存；

(9)封板膜2张；

(10)说明书1份。