[发明专利]一种新型耐低温高碱性高效脱氮菌及其筛选方法、应用

权利要求书

1.一种新型耐低温高碱性高效脱氮菌株，其特征在于，名称为反应假单胞菌(Pseudomonas reactans)WL20-3，保藏于中国微生物菌种管理委员会普通微生物中心，保藏名称为WL20-3，其保藏号为：CGMCC NO.25785。

2.根据权利要求1所述的一种新型耐低温高碱性高效脱氮菌株，其特征在于：所述菌株WL20-3能在(NH₄)₂SO₄、NaNO₃、NaNO₂为唯一氮源的液体培养基上生长；且在营养琼脂培养基上培养时，形成表面光滑湿润、不透明、边缘完整隆起呈现圆形的白色菌落。

3.根据权利要求1所述的一种新型耐低温高碱性高效脱氮菌株，其特征在于，其16SrRNA基因序列如SEQ ID NO.1所示。

4.权利要求1所述新型耐低温高碱性高效脱氮菌株的筛选方法，其特征在于，所述筛选方法包括以下步骤：

a、菌株的富集与分离：取脱水污泥样品于细菌富集培养基中，制备菌悬液；吸取菌悬液移至细菌富集培养基中，振荡培养，为第一个富集培养周期，以此类推，进行多次富集培养；后稀释液涂布于同时硝化反硝化培养基平板上，待平板上长出单菌落，挑取不同单菌落；

b、菌株纯化：挑取步骤a单菌落并在LB培养基中纯化2～3次；

c、异养硝化菌株的初步筛选：将上述纯化菌株接入硝化培养基中，于4℃条件下进行硝化性能测试，采用氨氮分析测试盒进行显色分析，挑选在4℃条件下脱氮性能较好的菌株；

d、好氧反硝化菌株的初步筛选：将步骤c中挑选的菌株接入到反硝化培养基中，于4℃条件下进行反硝化性能测试，采用阴离子色谱对溶液中硝酸盐、亚硝酸盐进行分析，从中挑选出在4℃条件下脱氮性能较好的菌株，该菌株为耐低温异养硝化-好氧反硝化菌株；

e、低温高碱性脱氮菌株复筛：将经过步骤d筛选的菌株接种于pH11.0的硝化培养基和反硝化培养基中，于4℃条件下培养，最终筛选到耐低温高碱性异养硝化-好氧反硝化菌株。

5.根据权利要求4所述筛选方法，其特征在于所述培养基按下述比例配制：

LB培养基：5g/L酵母浸出粉，10g/L胰蛋白胨，10g/L氯化钠；

细菌富集培养基：5g/L葡萄糖，1g/L硝酸钠，4g/L磷酸二氢钾，6g/L磷酸氢二钾，1g/L氯化钠，0.2g/L硫酸镁；

硝化反硝化培养基：0.078g/L硫酸氨，0.101g/L硝酸钠，0.082g/L亚硝酸钠2.81g/L六水琥珀酸钠，0.2g/L七水硫酸镁，1.50g/L磷酸二氢钾，10.09g/L十二水磷酸氢二钠，2mL微量元素溶液/L培养基；

硝化培养基：0.236g/L硫酸氨，2.81g/L六水琥珀酸钠，0.2g/L七水硫酸镁，1.5g/L磷酸二氢钾，10.09g/L十二水磷酸氢二钠，2mL微量元素溶液/L培养基；

反硝化培养基：0.303g/L硝酸钠，2.81g/L六水琥珀酸钠，0.2g/L七水硫酸镁，1.5g/L磷酸二氢钾，10.09g/L十二水磷酸氢二钠，2mL微量元素溶液/1L培养基；

微量元素溶液：5g/L乙二胺四乙酸二钠，3.92g/L七水硫酸锌，5.50g/L氯化钙，5.06g/L四水氯化锰，5.0g/L七水硫酸亚铁，1.10g/L四水钼酸氨，1.57g/L五水硫酸铜，1.61g/L六水氯化钴。

6.采用权利要求1所述新型耐低温高碱性高效脱氮菌株制备的菌剂。

7.权利要求1所述新型耐低温高碱性高效脱氮菌株在脱氮技术领域中的应用。

8.根据权利要求7所述应用，其特征在于，所述新型耐低温高碱性高效脱氮菌株在温度为3～35℃的水体中的脱氮应用。

9.根据权利要求7所述应用，其特征在于，所述新型耐低温高碱性高效脱氮菌株在pH值为7.0～11.0的水体中的脱氮应用。

10.根据权利要求7所述应用，其特征在于，所述新型耐低温高碱性高效脱氮菌株用于脱除水体中的氨氮、硝态氮、亚硝态氮其中任意一种或多种。