[发明专利]一种鉴定欧洲樱桃实蝇的特异性引物、试剂盒及其应用

说明书

本发明涉及一种鉴定欧洲樱桃实蝇的特异性引物、试剂盒及其应用。特异性引物的序列包括SEQ ID NO.1所示的序列和SEQ ID NO.2所示的序列。用于鉴定欧洲樱桃实蝇的试剂盒包括上述引物。本发明采用上述引物和/或试剂盒建立的快速检测欧洲樱桃实蝇的分子生物学检疫鉴定方法，具有检出率高、检疫时间短、特异性强、灵敏度高等优点。

本发明为分案申请，原中国发明专利申请号为：202010924705.8，申请日为：2020年9月5日，申请时发明专利名称为：一种鉴定欧洲樱桃实蝇的特异性引物、探针及其应用。

技术领域

本发明属于昆虫检疫鉴定技术领域，尤其涉及一种鉴定欧洲樱桃实蝇的特异性引物、试剂盒及其应用。

背景技术

欧洲樱桃实蝇Rhagoletiscerasi(L.)隶属于双翅目Tephr it idae，实蝇科Tephrit idae，绕实蝇属Rhagoletis。绕实蝇属(非中国种)是《中华人民共和国进境植物检疫性有害生物名录》中规定的我国禁止进境的检疫性有害生物。

欧洲樱桃实蝇主要分布在欧洲和亚洲等地区，其是一种高度毁灭性昆虫，严重危害欧洲、亚洲等地区的樱桃产业。在欧洲如不进行化学防治，其侵染率可高达100％，产量损失高达60％-100％。该实蝇寄主植物广泛，包括各种不同种类的李属植物(蔷薇科；酸樱桃，欧洲甜樱桃，黑樱桃，马哈利酸樱桃)，忍冬属植物(忍冬科；金银忍冬、新疆忍冬)和小檗属植物(刺檗)等。此外，针对欧洲樱桃实蝇的防除工作十分困难，人们至今未找到防治欧洲樱桃实蝇的有效办法。

欧洲樱桃实蝇为《进口乌兹别克斯坦樱桃、乌拉圭柑橘和智利鳄梨植物检验检疫要求的公告》(2017年第55号)、《进口新西兰柿子和土耳其鲜食樱桃植物检验检疫要求》(2016年第51号)、《关于进口塔吉克斯坦樱桃植物检验检疫要求的公告》(2013年第79号)等文件规定需要关注的有害生物。2017年-2018年，广州机场、珠海口岸多次在旅客携带樱桃果实中截获该实蝇幼虫；乌鲁木齐口岸在吉尔吉斯斯坦进口樱桃中也截获该实蝇幼虫。2017年原国家质检总局发布《关于严防欧洲樱桃实蝇随旅客携带物非法进境的警示通报》(质检动警[2017]第038号)。此外，我国北方大部分地区均处于温带地区，与欧洲樱桃实蝇分布纬度一致，推测其在我国的适生区范围很广。另外，我国广泛种植樱桃、忍冬等欧洲樱桃实蝇的寄主植物，2016年我国已超过土耳其成为世界第一樱桃生产大国。忍冬属植物是我国重要的水土保持、园林绿化及药用栽培品种，种植面积巨大，经济价值较高。由此可见，该实蝇一旦传入我国，将对我国的樱桃产业和园林绿化等产业造成严重打击，并将严重影响我国水果的出口贸易，从而带来巨大经济损失。为保护我国农林业生产生态安全，有效防止该害虫的入侵定殖和传播，加强该害虫的快速检疫鉴定方法的研究具有重要意义。

目前，针对欧洲樱桃实蝇的检疫鉴定，进出境口岸检验检疫部门仍主要依赖该实蝇成虫形态特征进行鉴定，对于幼虫等其他虫态的鉴定一直是一个难题。大多数情况下实蝇的幼虫是最主要的截获虫态，而大多数实蝇幼虫形态特征普遍较相似，很难通过形态特征进行幼虫种类的区分，因此口岸检验检疫部门一般采用分子生物学方法进行幼虫的鉴定。利用通用引物测序方法进行的幼虫鉴定步骤较复杂，需要时间也较长：(1)将截获的实蝇幼虫提取DNA；(2)提取的DNA用昆虫COI基因等的通用引物进行PCR检测；(3)PCR产物进行凝胶电泳检测是否得到目标条带；(4)检测获得目标条带后将PCR产物送测序公司测序，等待测序结果；(5)将测序结果在NCBI网站上进行Bl ast序列比对，分析序列比对结果后判定是否为欧洲樱桃实蝇。这一过程往往需要3-7天才能完成，无法满足日常口岸快速准确灵敏鉴定的工作需要。

目前，针对欧洲樱桃实蝇的快速检疫鉴定方法还没有方法，也没有相应的国家标准、行业标准。因此，能够快速、准确的检测欧洲樱桃实蝇是一项急需解决的难题。

发明内容