[发明专利]抗猫CTLA4单克隆抗体的制备及其用途

说明书

本发明公开了一种抗猫CTLA4单克隆抗体的制备及其用途。本发明合成了猫CTLA4多肽，偶联KLH蛋白后加入等体积的弗氏佐剂（200μl）混合乳化后作为小鼠免疫抗原，通过背部左腹皮下多点注射免疫Balb/c小鼠；其中只有首次小鼠免疫用弗氏完全佐剂，二次、三次、四次加强免疫都用弗氏不完全佐剂，最后一次用少量CTLA4多肽抗原冲击免疫。将ELISA检测中效价高的小鼠脾细胞，通过PEG方法与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0融合，采用选择培养基，筛选出细胞融合后的杂交瘤细胞；再通过间接酶联免疫法筛选细胞并进行四次亚克隆，最终得到1株抗猫CTLA4单克隆抗体细胞株，及其分泌的单克隆抗体。得到的抗猫CTLA4单克隆抗体亲和力高，能有效识别细胞表面的CTLA4蛋白，可用于Western Blot和流式检测应用。

技术领域

本发明属于生物技术中的抗体制备领域，特别是涉及抗猫CTLA4单克隆抗体的制备及其用途。

背景技术

CTLA4全名细胞毒T淋巴细胞相关抗原4，又名CD152，其基因定位于2号染色体长臂33带（2q33），主要表达于活化的T细胞表面，与T细胞表面的协同刺激分子受体CD28具有高度的同源性。CTLA4和CD28均为免疫球蛋白超家族成员，二者与相同的配体CD86（B7-2）和CD80（B7-1）结合。CD28信号传导促进细胞因子IL-2 mRNA的产生和进入细胞周期、T细胞存活、T辅助细胞分化和免疫球蛋白同型转换。与CD28相反，CTLA4抑制T细胞的活化,参与免疫反应的负调节。基因重组的CTLA4 Ig可在体内外有效、特异地抑制细胞和体液免疫反应，对移植排斥反应及各种自身免疫性疾病有显著的治疗作用，毒副作用极低，是目前被认为较有希望的新的免疫抑制药物。在宠物自身免疫病和肿瘤研究中，缺乏各种靶向单克隆抗体。因此，开发犬源或猫源单克隆抗体对宠物自身免疫病和肿瘤的免疫疗法和疾病的诊断具有重要的意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种高亲和力、高生物活性的靶向于猫CTLA4的单克隆抗体制备方法及其Western Blot和流式应用验证。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

第一方面，本发明提供了一种合成猫CTLA4多肽氨基酸序列，抗原多肽序列为SEQID NO 1。

第二方面，本发明提供一种结合猫CTLA4的单克隆抗体，所述单克隆抗体在制备过程中，免疫小鼠所用的抗原多肽序列为SEQ ID NO.1，所述单克隆抗体的重链和轻链可变区的氨基酸序列分别是SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列，所述单克隆抗体的重链和轻链可变区的核苷酸序列分别是SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列。

第三方面，本发明提供一种结合猫CTLA4的单克隆抗体。

第四方面，本发明提供了两种所述的单克隆抗体在检测猫CTLA4表达蛋白的应用。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明合成猫CTLA4多肽氨基酸序列偶联KLH蛋白，记为多肽CTLA4-KLH，经DMSO溶解和PBS稀释，加入等体积的弗氏佐剂（200μl）混合乳化后作为小鼠免疫抗原，通过背部左腹皮下多点注射免疫Balb/c小鼠；其中只有首次小鼠免疫用弗氏完全佐剂，二次、三次、四次加强免疫都用弗氏不完全佐剂，最后一次用少量CTLA4多肽抗原冲击免疫。将ELISA检测中效价高的小鼠脾细胞，通过PEG方法与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0融合，采用选择培养基，筛选出细胞融合后的杂交瘤细胞；再通过间接竞争酶联免疫法筛选细胞并进行四次亚克隆，最终得到了猫CTLA4单克隆抗体细胞株，及其分泌的单克隆抗体。

本发明提供的靶向于猫CTLA4的单克隆抗体对猫CTLA4蛋白具有高亲和力、高生物活性，所述抗体能够与猫CTLA4抗原高亲和力结合，有效识别细胞表面的CTLA4蛋白，可用于Western Blot和流式中对于猫CTLA4蛋白的检测。

附图说明