[发明专利]用于鉴别猪瘟病毒2型感染的单克隆抗体制备方法及应用

说明书

本发明涉及检测病毒的抗体制备技术，旨在提供一种用于鉴别猪瘟病毒2型感染的单克隆抗体制备方法及应用。本发明提供了组杆状病毒表达的CSFV 2型E2蛋白，该蛋白的编码区cDNA序列如SEQ ID NO.5所示。将前述CSFV 2型E2蛋白经纯化处理后，施用于经CSFV 2型毒株HZ08全病毒免疫后的小鼠以实现混合免疫；利用小鼠骨髓瘤细胞SP2/0和混合免疫后小鼠的脾脏细胞，制备杂交瘤细胞株；经过筛选和亚克隆，获得能稳定分泌特异性抗体的单克隆细胞株；对所获单克隆抗体进行亚型测定、IFA鉴定、免疫印迹鉴定和表位鉴定，筛选出能够阻断ELISA体系的单克隆抗体。本发明制得的单克隆抗体能够用于区分CSFV流行株和疫苗株，或区分接种疫苗的动物和自然感染的动物。

技术领域

本发明涉及检测病毒的抗体制备技术，特别涉及用于鉴别猪瘟病毒2型感染的单克隆抗体制备方法及应用。

背景技术

猪瘟(Classical swine fever,CSF)是感染家猪及野猪的重要病毒病，是由猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)引起的严重危害全球养猪业的一种烈性传染病，具有高传染性和高致病性的特点。由于猪瘟的全球分布以及它对全球养猪业造成的巨大经济损失，被世界动物卫生组织(OIE)规定必须报告的疫病之一，在我国属于二类动物疫病。该病在1833年首次被发现于美国的俄亥俄州，自首次报道之后，迅速传播至世界各地。目前该传染病仍然在亚洲、欧洲、中美洲、南美洲大部分国家和少数非洲国家等地呈地方性或散发性流行。

CSFV属于黄病毒科(Flaviviridae)瘟病毒属(Pestivirus)成员，公认与CSFV同属于瘟病毒属的还包括1型牛病毒性腹泻病毒(BVDV-1)，2型牛病毒性腹泻病毒(BVDV-2)，羊边界病毒(BDV)。CSFV是有囊膜的单股正链RNA病毒，基因组大小约12.3kb，包含一个大的开放阅读框(Open Reading Frame，ORF)，两侧是5’端非编码区(5’untranslated region,5’-UTR)和3’端非编码区(3’untranslated region,3’-UTR)。ORF编码一个由3898个氨基酸组成的多聚蛋白，该多聚蛋白在病毒和宿主细胞蛋白酶的作用下裂解成12个成熟的病毒蛋白，其中4种结构蛋白和8种非结构蛋白，结构蛋白包括核衣壳蛋白C和3个囊膜糖蛋白，Erns、E1和E2，非结构蛋白包括Npro、p7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B。每个成熟蛋白在猪瘟病毒的生命周期与感染过程中发挥不同的功能。

CSFV包含3个基因型和11个基因亚型(1.1,1.2,1.3,1.4,2.1,2.2,2.3,3.1,3.2,3.3和3.4)。我国自1954年研制出了安全有效的减毒疫苗(CSFV弱毒C株)，普遍实行猪瘟疫苗强制接种政策，有效地控制了该病的大规模爆发流行。CSFV弱毒C株是由CSFV 1型强毒株Shimen在兔体连续传代致弱后得到，接种1次即可对高致病性病毒产生良好的保护作用且提供终身免疫，是最安全有效的兽用疫苗之一。

C株疫苗的广泛应用成功控制了我国CSF的流行，但在C株疫苗的压力下，自21世纪初以来，1.1亚基因型逐渐退出流行舞台，目前国内生猪主产区流行的CSFV毒株以亚基因2.1型为主，如QZ14株、HZ08株、HuN23株、HLJ1株等。C株被公认为安全有效的CSF疫苗，但不具备为相关检测试剂盒提供鉴别CSFV野毒感染血清抗体和疫苗C株免疫血清抗体的能力，无法最终净化猪瘟。目前流行的CSFV亚基因型2.1型流行株与C株同源性较低，可能影响基于基因1型的C株疫苗免疫保护效果。因此，建立有效的CSFV流行株感染血清抗体和C株免疫血清抗体的快速鉴别技术是目前亟待解决的重要问题，这将进一步推动猪瘟病毒的净化。