[发明专利]一种紫点海葵多肽毒素HC-G02及其合成方法、应用

说明书

本发明提供一种紫点海葵多肽毒素HC‑G02及其合成方法、应用，其氨基酸序列为APCSGCYYQVGNECVYDKLKC‑NHsubgt;2/subgt;。通过采用多肽固相合成法合成了线性肽HC‑G02，对线性肽进行纯化后纯度达到95％以上。通过定点氧化后获得紫点海葵氧化肽HC‑G02(二硫键的连接方式为C1‑C3，C2‑C4)。本发明通过热板实验测试发现紫点海葵氧化肽HC‑G02对小鼠物理性疼痛具有良好的镇痛作用，小鼠腹腔注射氧化肽HC‑G02后，在30min痛阈提高率逐渐升高，给药后120min痛阈提高率达到最高。氧化肽HC‑G02在50mg/kg下的镇痛效果与同等浓度的曲马多的镇痛效果相当，且镇痛时间延长。

技术领域

本发明属于活性多肽技术领域，涉及一种紫点海葵多肽毒素HC-G02及其合成方法、应用。

背景技术

海葵为刺胞门、珊瑚虫纲、海葵目生物，是在世界范围内的深海和浅海水域都能够发现的一种海洋动物。海葵是现存最古老的有毒动物目之一，分子和化石数据表明它们的起源早于7.5亿年前的埃迪卡拉纪。海葵种类繁多，在全球已记录海葵目1100余种，分属于50科约400个属，而中国海葵物种约占世界的1/10。中国海葵物种多样性在南海分布最高。海葵触手上具有刺细胞，与其他刺胞动物一样，海葵将毒液集中在被称为刺丝囊的囊状细胞器中。与猎物接触时刺丝囊会穿透目标生物体，释放毒液麻痹或杀死对方以进行捕食、防御和威慑竞争对手。

《中华本草》和《中国药用动物志》记载海葵具有收敛固涩等功效，民间主要用来治疗痔疮、脱肛、绕虫病和体癣等。现代药理学研究表明海葵毒素具有镇痛等作用。

发明内容

本发明从紫点海葵中筛选出活性多肽序列，并通过氧化折叠合成紫点海葵功能多肽。通过镇痛实验阐明该海葵多肽具有一定镇痛活性。本发明为开发新型海洋药物奠定基础，为人类健康和海洋药物研究提供有力支撑。

本发明方案为：

一种紫点海葵多肽毒素HC-G02，其氨基酸序列为APCSGCYYQVGNECVYDKLKC-NH₂，其具有四个半胱氨酸形成两个二硫键，二硫键的连接方式为C1-C3，C2-C4。

本发明还提供了所述紫点海葵多肽毒素HC-G02的合成方法，包括以下步骤：

(1)称取树脂，先用二氯甲烷浸泡，然后依次用二甲基甲酰胺和二氯甲烷洗涤，加入Fmoc-Ala-OH、二氯甲烷和N,N-二异丙基乙胺进行反应，再加入甲醇和二氯甲烷反应，用二甲基甲酰胺洗涤，再加入含吡啶的二甲基甲酰胺溶液洗涤，得到第一个树脂；

(2)在第一个树脂中加入第二个氨基酸Fmoc-Pro-OH和缩合剂，再加入二甲基甲酰胺和N,N-二异丙基碳二亚胺反应，再加入含哌啶的二甲基甲酰胺溶液洗涤，得到第二个树脂；

(3)根据前述的HC-G02的氨基酸序列，重复步骤(2)直到肽链结束，得到线性肽树脂；

(4)向线性肽树脂中加入甲醇进行冲洗并抽干，加入切割液切割，过滤后，加入冰乙醚，离心去除上层液冰乙醚，得到沉淀多肽粗品；

(5)纯化多肽粗品，得纯品线性肽HC-G02；

(6)将步骤(5)的线性肽溶于甲醇水溶液中，再用乙酸稀释，滴加甲醇碘溶液，保持搅拌，形成第一个二硫键；

(7)再加入等体积盐酸-甲醇溶液，然后加入甲醇碘溶液，保持搅拌，形成第二个二硫键；

(8)纯化后得到多肽纯品。