[发明专利]一种核酸序列扩增和标记的方法

权利要求书

1.一种核酸序列扩增和标记的方法，包括：

步骤1：将核酸序列、扩增反应混合物与载体共同分配至分区；

其中，扩增反应混合物包含核苷酸单体混合物、核酸聚合酶、和/或引物；载体包含与之连接的多个核酸条形码分子；

步骤2：将核酸条形码分子从载体上释放至分区内；

步骤3：在温控程序下对核酸序列进行扩增，并将核酸条形码分子附接至分区内核酸序列的扩增子序列上以进行核酸条形码化标记。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：

所述扩增反应混合物包含：核苷酸单体混合物、核酸聚合酶和第一引物，第一引物包括通用序列和可变序列，核酸聚合酶可用于PCR反应且具有链置换活性；

所述核酸条形码分子的3'端包含所述通用序列作为扩增标记核酸序列的第二引物；

所述温控程序包括两段，在第一温度循环程序下，使得第一引物的可变序列与模板核酸序列退火并通过聚合酶进行延伸，得到核酸扩增产物1，其中核酸扩增产物的5'端包含所述通用序列，3'端包含所述通用序列的互补序列；在第二温度循环程序下，使得所述核酸条形码分子上的第二引物退火至核酸扩增产物的3'端并通过聚合酶进行延伸，得到扩大的核酸扩增产物2，其中扩大的核酸扩增产物2被所述核酸条形码分子的条形码序列所标记。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：

所述扩增反应混合物包含核苷酸单体混合物和核酸聚合酶，核酸聚合酶具有链置换活性；

所述核酸条形码分子的3'端包含可变序列作为扩增标记核酸序列的引物；

所述温控程序选自温度循环程序和恒温扩增程序；

其中，在温度循环程序下，使得所述核酸条形码分子上的引物与模板核酸序列退火并通过聚合酶进行延伸，得到核酸扩增标记产物，其中核酸扩增标记产物的5'端包含核酸条形码分子序列，3'端包括核酸条形码分子序列的互补序列；

在所述恒温扩增程序下，使得所述核酸条形码分子上的引物与模板核酸序列退火并通过聚合酶进行延伸，得到核酸扩增标记产物，所述核酸扩增标记产物的5'端包含核酸条形码分子序列。

4.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其中所述分区内的核酸序列的扩增标记反应为一锅法反应，在所述分区内使反应物连续进行一步或多步反应。

5.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其中所述核酸序列作为扩增反应的底物，包括基因组脱氧核糖核酸，所述脱氧核糖核酸可选自以下一种或多种：质粒、经过降解得到的病毒的基因组、经过裂解得到的单细胞或多个细胞的全基因组、RNA逆转录得到的cDNA。

6.根据权利要求5所述的方法，其中所述细胞选自真核生物细胞或微生物细胞。

7.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其中所述聚合酶选自BstDNA聚合酶(全长)、BstDNA聚合酶(大片段)、BstDNA2.0聚合酶、Bst3.0DNA聚合酶、Bst(exo-)DNA聚合酶、Phi29DNA聚合酶、DeepVent(exo-)DNA聚合酶、DeepVentDNA聚合酶、Vent(exo-)DNA聚合酶、VentDNA聚合酶、KlenowFragmentDNA聚合酶Ⅰ中的一种或多种。

8.根据权利要求2所述的方法，其中所述第一引物和第二引物包含的通用序列是一段特定序列，其被选择使得基本上不会与模板核酸序列结合产生扩增。

9.根据权利要求2-3任一项所述的方法，其中所述可变序列选自(N)_n、(N)_nGGG和(N)_nTTT中的至少一种，其中N为任意可与天然核酸进行碱基配对的随机核苷酸，n为选自3-17的正整数。