[发明专利]一种里氏木霉重组菌株、其制备方法及其应用

说明书

本发明提供了一种里氏木霉重组菌株、其制备方法及其应用，该里氏木霉重组菌株为里氏木霉TrEP‑4，里氏木霉TrEP‑4为可过表达伴侣蛋白的里氏木霉。本申请的里氏木霉重组菌株TrEP‑4可过表达伴侣蛋白。因而，利用该重组菌株进行纤维素酶的生产，能够在促进蛋白质的正确折叠及分泌的情况下，得以高效分泌表达纤维素酶，降低里氏木霉产酸性纤维素酶的生产成本。

技术领域

本发明涉及农业生物技术领域，具体而言，涉及一种里氏木霉重组菌株、其制备方法及其应用。

背景技术

纤维素是通过β-1，4糖苷键连接葡萄糖而成的同聚多糖，它是植物细胞壁的主要成分，是地球上最丰富的可再生资源。纤维素酶是一种能够将纤维素降解为葡萄糖的复合酶系，根据在纤维素上的作用位点可以分为内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶以及β-葡萄糖苷酶。以纤维素为底物时，内切葡聚糖酶能够识别并切割纤维素内部非结晶区的β-1，4葡萄糖苷键，从而释放出不同长度的短链纤维寡糖和纤维多糖，为外切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶提供底物。因此，内切葡聚糖酶在纤维素的水解过程中扮演着重要角色，内切葡聚糖酶活力的高低往往直接影响纤维素酶对纤维素的水解效率。

里氏木霉(Trichoderma reesei)是当前生物界中分泌纤维素酶能力最强的微生物之一，并且其胞外分泌的纤维素酶系较全，其内切葡聚糖酶具有很好的热稳定性并且在酸性条件下具有很好的活性，使其在纺织、生物能源以及食品加工等领域具有很好的应用潜力。大量文献研究发现，在里氏木霉表达系统中蛋白表达的同时往往伴随着某些伴侣蛋白基因的上调，比如pdi1、bip1等，这些基因的功能是直接帮助新生肽链和解折叠的蛋白质肽链折叠成具有生物功能构象的蛋白质，因此，在蛋白质分泌途径中内质网的折叠和加工被认为是分泌成熟蛋白的重要过程。

目前影响纤维素酶产业化的主要因素是酶的产量低，因此提高酶的产量并降低生产成本是其完成产业化亟需解决的问题。

发明内容

本发明的主要目的在于提供一种里氏木霉重组菌株、其制备方法及其应用，以解决现有技术中纤维素酶产量低的问题。

为了实现上述目的，根据本发明的第一个方面，提供了一种里氏木霉重组菌株，里氏木霉重组菌株为里氏木霉TrEP-4，里氏木霉TrEP-4为可过表达伴侣蛋白的里氏木霉。

进一步地，里氏木霉重组菌株中包含编码伴侣蛋白的核酸分子的重组质粒；优选地，伴侣蛋白为二硫键异构酶PDI1；优选地，编码伴侣蛋白PDI1的核酸分子为表达盒Pcbh1-pdi1-Tcbh1，其中，Pcbh1表示纤维二糖水解酶I启动子Pcbh1，pdi1表示伴侣蛋白基因pdi1，Tcbh1表示纤维二糖水解酶I终止子Tcbh1；优选地，重组质粒还包括氨苄青霉素抗性基因AmpR及筛选标记基因pyr4；优选地，重组菌株的出发菌株为包含重组质粒的里氏木霉TU-6；优选地，里氏木霉TU-6保藏号为ATCC MYA-256。

进一步地，表达盒中的纤维二糖水解酶I启动子Pcbh1、伴侣蛋白基因pdi1及纤维二糖水解酶I终止子Tcbh1均来自里氏木霉；优选地，伴侣蛋白基因pdi1的DNA序列如SEQ IDNO：1所示。

为了实现上述目的，根据本发明的第二个方面，提供了一种生产纤维素酶的方法，方法包括：利用上述里氏木霉重组菌株制备孢子悬液；将孢子悬液进行种子培养，得到种子液；将种子液进行摇瓶发酵，得到发酵后的上清液，即为纤维素酶。

进一步地，制备孢子悬液包括：将里氏木霉重组菌株接种至PDA培养基，进行产孢培养，得到孢子悬液；优选地，产孢培养的温度为28-30℃；优选地，产孢培养的时间为5-6d；优选地，孢子悬液中孢子浓度为1×10⁷-10⁸个/mL。