[发明专利]一种重组L-氨基酸脱氨酶大肠杆菌基因工程菌及其构建方法和应用

说明书

本发明公开了一种重组L‑氨基酸脱氨酶大肠杆菌基因工程菌及其构建方法和应用，所述工程菌以来源于Proteusmirabilis的氨基酸脱氨酶基因为模板，将该酶命名为PM473，以pET‑20b为载体，重组转化到BL21(DE3)大肠杆菌中获得适合氨基酸脱氨功能的E.coli BL21(DE3)/pET20b‑PM473基因工程菌，使用验证过的基因工程菌生产L‑氨基酸脱氨酶大肠杆菌全细胞催化剂，可以催化谷氨酰胺生产α‑酮戊二胺酸并实现对混旋体的手性拆分，催化产物只有α‑酮戊二胺酸和副产物NHsubgt;3/subgt;，以及剩余未反应的D‑谷氨酰胺，分离纯化简单。对反应时间加以控制，混旋底物中的L‑谷氨酰胺转化率为100％，D‑谷氨酰胺转化率为58.5％。该酶还可以催化L‑丙氨酸，L‑苏氨酸，苯丙氨酸，半胱氨酸生产相应的α‑酮酸。

技术领域

本发明涉及一种餐饮业废水处理装置，具体涉及一种重组L-氨基酸脱氨酶大肠杆菌基因工程菌及其构建方法和应用。

背景技术

α-酮酸是一种重要的精细化工中间体，在医药、食品添加剂、食品、化妆品等化学合成领域有着广泛的应用。现阶段市场上大部分的酮酸都是通过化学合成的方法制备的，这样生产不仅不环保，而且还会产生各种有毒的副产品。随着生物工程技术的发展，酮酸的生物合成已被发现，并在微生物中应用不同的代谢工程策略以可再生碳水化合物生产特定的酮酸。

α-酮戊二胺酸(α-ketoglutaramic acid)，又叫做α-酮谷氨酸(α-ketoglutaramate)，2-氧戊二胺酸(2-oxoglutaramate)，2-羟基-5-氧脯氨酸(2-hydroxy-5-oxoproline)，在植物体内通过转氨酶和水解酶的连续作用下进行合成和代谢；在动物肝脏和肾脏中也发现了类似的转氨酶、水解酶以及α-酮戊二胺酸。α-酮戊二胺酸作为植物生长调节剂在农业上具有广泛的用途；在生物学研究中，人类ω-酰胺酶(腈水解酶，Nitrilase 2)已被确定为一种公认的肿瘤抑制蛋白，可将癌细胞抑制在G2细胞周期阶段，Nitrilase 2信息在研究过的每一个人体组织(心脏、大脑、胎盘、肺、肝脏、骨骼肌、肾脏、胰腺、脾脏、胸腺、前列腺、睾丸、卵巢、小肠、结肠和白细胞)中都有表达，在肝脏和肾脏中表达最高，而α-酮戊二胺酸作为Nitrilase2的底物，是研究该酶的规范作用和该酶在多种疾病中的作用所必需的。目前生产α-酮戊二胺酸最容易利用的制备方法是以蛇毒衍生的L-氨基酸氧化酶氧化L-谷氨酰胺，这不仅成本昂贵，而且在生产过程中会产生有害的H₂O₂。

发明内容

本发明的目的在于提供一种重组L-氨基酸脱氨酶大肠杆菌基因工程菌及其构建方法和应用，其可以解决上述背景技术提出的技术问题。

在本发明的一个方面，本发明提出了一种重组L-氨基酸脱氨酶大肠杆菌基因工程菌。根据本发明的实施例，以来源于Proteus mirabilis的L-氨基酸脱氨酶基因为模板，将该酶命名为PM473，以pET-20b为载体，以SalI-XhoI为克隆位点，重组转化到大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3)中获得重组L-氨基酸脱氨酶大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pET20b-PM473基因工程菌。

在本发明的另一方面，本发明提出了一种重组L-氨基酸脱氨酶大肠杆菌基因工程菌的构建方法。根据本发明的实施例，以来源于Proteus mirabilis的L-氨基酸脱氨酶基因GeneBank:MG746627.1为模板，将该酶命名为PM473，以SalI-XhoI为克隆位点将PM473插入到pET-20b载体中，通过PCR扩增技术，得到重组表达质粒pET20b-PM473，将重组表达质粒pET20b-PM473转化到大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3)中，经过氨苄青霉素抗性筛选、酶切、菌液PCR和SDS-PAGE验证后获得重组L-氨基酸脱氨酶大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pET20b-PM473基因工程菌。