[发明专利]一种用于生产神经酰胺的毕赤酵母菌株及其构建方法和应用

说明书

本发明涉及生物技术领域，尤其是涉及一种用于生产神经酰胺的毕赤酵母菌株及其构建方法和应用。本发明首次利用毕赤酵母菌株同时过表达lcb1基因、lcb2基因和XP_002490234基因以合成神经酰胺；并且本发明过表达基因的毕赤酵母菌株可以实现高密度培养，解决了毕赤酵母菌株高密度培养时细胞氧化损伤问题，从而提高神经酰胺的产量。经过基因改造后的毕赤酵母菌株产生的神经酰胺总量或者不饱和脂肪酸神经酰胺占比均获提高，其中含饱和脂肪酸的神经酰胺占总脂质2.025％，含不饱和脂肪酸的神经酰胺占0.426％，合计2.451％，比出发菌株提高82.64％；其中含不饱和脂肪酸的神经酰胺占所有神经酰胺比例为17.38％，比出发菌株提高48.55％。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其是涉及一种用于生产神经酰胺的毕赤酵母菌株及其构建方法和应用。

背景技术

神经酰胺是广泛存在于真核细胞的脂类物质，是体内重要的脂质第二信使，广泛参与了细胞的增殖、分化、凋亡及损伤等生理病理过程。神经酰胺是由神经鞘氨醇和长链脂肪酸通过共价缩合而成的，根据鞘胺醇的碳链的长度不同，碳链的不饱和度不同以及羟基数目的不同，以及与鞘胺醇连接的脂肪酸的碳链长度不同、不饱和键的数目不同、不饱和键位置和羟基的位置、数目等的不同，神经酰胺分子表现出多样性。

近年研究发现，神经酰胺是皮肤角质层细胞间脂质的重要组分，具有维持皮肤屏障、保湿、抗衰老等功能，因而在化妆品及保健食品领域得到了极大的应用，目前神经酰胺的原料市场需求持续增长，因此，迫切的需要一种经济、安全、高效的手段来生产神经酰胺。利用微生物转化合成神经酰胺获得了越来越多的关注。相比于传统的化学生产，微生物工厂有以下优势：它们可利用可再生原料，生产绿色环保，对环境友好，同时可以基于生物合成生产一些化学合成难以生产的物质。酵母作为单细胞真核生物，其生产周期短，发酵生产原料来源丰富，易于大规模生产，且遗传背景清晰，易于进行遗传操作，在代谢工程改造方面具有优势，是一种理想的底盘细胞，可以为工业大规模高密度发酵生产产物创造更加有力的条件，为企业带来更大的经济效益。

鞘脂的合成开始于内质网，其中丝氨酸棕榈酰转移酶(SPT)将丝氨酸与脂肪酰基辅酶A缩合，生成3-酮二氢鞘氨醇(酮鞘氨醇)和CO₂，而SPT是由Lcb1和Lcb2亚单位蛋白质制成的异二聚体。

目前神经酰胺主要通过酿酒酵母制备获得，尚无利用毕赤酵母生产的报道。而酿酒酵母相对毕赤酵母而言，培养密度较低，影响了神经酰胺的量产；并且，毕赤酵母在高密度发酵培养条件下，存在氧化损伤胁迫，甲醇代谢中产生的活性氧物质(ROS)会攻击胞内生物分子，造成含不饱和脂肪酸的神经酰胺的降低。

发明内容

本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种用于生产神经酰胺的毕赤酵母菌株及其构建方法和应用。本发明的毕赤酵母菌株同时过表达lcb1基因、lcb2基因和XP_002490234基因，可以较好地合成神经酰胺，且毕赤酵母菌株可以实现高密度培养，细胞不易氧化损伤，从而提高神经酰胺的产量。

第一目的，本发明提供了一种用于生产神经酰胺的毕赤酵母菌株，所述毕赤酵母菌株同时过表达lcb1基因、lcb2基因和XP_002490234基因。

本发明首次利用毕赤酵母菌株同时过表达lcb1基因、lcb2基因和XP_002490234基因以合成神经酰胺；并且本发明过表达基因的毕赤酵母菌株可以实现高密度培养，解决了毕赤酵母菌株高密度培养时细胞氧化损伤问题，从而提高神经酰胺的产量。

其中，毕赤酵母菌株过表达XP_002490234基因，可以调节细胞的氧化/过氧化状态。

作为本发明所述毕赤酵母菌株的优选实施方式，所述lcb1基因、lcb2基因编码丝氨酸棕榈酰转移酶亚基。

作为本发明所述毕赤酵母菌株的优选实施方式，所述毕赤酵母菌株为毕赤酵母GS115及其衍生菌，其是用途及其广泛的工业微生物宿主菌，可以实现高密度培养。