[发明专利]基于特异性抗原FHH的肝片吸虫胶体金检测方法

说明书

本发明公开了基于特异性抗原FHH的肝片吸虫胶体金检测方法，该检测方法采用肝片吸虫特异性抗原基因FHH、FHH蛋白、胶体金颗粒、金黄色葡萄球菌蛋白A标记的胶体金颗粒和检测试纸条进行检测。该方法具有简单快速、结果可视、成本低廉、且高特异性高灵敏性等优点。其中通过肝片吸虫成虫cDNA表达文库筛选所得的抗原基因FHH，保证了本发明的特异性。适用于临床快速诊断以及大规模的流行病学调查。

技术领域

本发明涉及免疫学技术领域，具体为基于特异性抗原FHH的肝片吸虫胶体金检测方法。

背景技术

肝片吸虫病是由肝片吸虫引起的一种重要的人兽共患寄生虫病，该病可感染多种哺乳动物，包括牛、羊、鹿等反刍动物，猪、马属动物以及部分野生动物，人也有感染的报道。该病能引发宿主肝炎与胆管炎，并伴有全身性中毒现象和营养障碍，不仅严重危害人类健康安全，同时也给畜牧养殖业带来极大的影响。肝片吸虫病目前常用的检测方法有病原学、分子生物学、免疫学方法等，病原学诊断多采用显微镜对病畜所排粪便样品虫卵进行观察，是肝片吸虫病的一种经典诊断手段，但是该方法存在消耗人力物力，检出率低，容易漏检等缺点。分子生物学诊断主要是以肝片吸虫特异性基因作为靶标来进行检测，尽管该方法具有高度的特异性和敏感性，但是对于仪器设备存在需求，适用于实验室检测，不适合在临床实践中推广应用。肝片吸虫免疫学诊断的原理是抗原抗体特异性结合，利用已知的肝片吸虫抗原(抗体)来检测抗体(抗原)。其中ELISA检测方法需要专业操作、相关仪器，且检测时间长；胶体金试纸条是一种检测快速、操作简单、结果直观、不需要专业操作与设备的诊断方法，适合临床检查。成熟可靠的免疫学诊断方法基于特异性好，敏感性高的抗原基因，所以，特异性抗原的选择尤为重要。且针对目前我国肝片吸虫病诊断抗原稀缺的问题，本发明通过肝片吸虫cDNA文库筛选出肝片吸虫特异性抗原基因，并以此为基础建立一种检测羊肝片吸虫的胶体金试纸条，并对临床样品进行检测。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的缺陷，提供基于特异性抗原FHH的肝片吸虫胶体金检测方法，以解决上述背景技术提出的问题。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：基于特异性抗原FHH的肝片吸虫胶体金检测方法，该检测方法包含肝片吸虫特异性抗原基因FHH、FHH蛋白、胶体金颗粒、金黄色葡萄球菌蛋白A标记的胶体金颗粒和检测试纸条进行检测，通过肝片吸虫cDNA表达文库筛选肝片吸虫特异性抗原基因FHH，建立了一种间接胶体金试纸条检测方法；检测过程中所述FHH蛋白与羊肝片吸虫感染阳性血清中的特异性抗体发生结合，使其胶体金免疫层析检测试纸条更具特异性；该试纸条可在常规环境中保存，无需仪器设备，且便于携带；该方法在15min左右即可肉眼观察结果，适合大范围临床样品检测。

作为本发明的一种优选技术方案，所述肝片吸虫特异性抗原基因FHH，其基因序列如序列1所示；其抗原基因FHH的扩增引物，利用CE designV1软件设计，使用酶切位点BamHI、Xho I，其核苷酸序列如序列2所示。

作为本发明的一种优选技术方案，所述FHH蛋白为纯化的pET-32a-FHH重组蛋白，使用生物信息学分析预测其可能具有较好的抗原性，并通过Western Blotting验证该蛋白具有良好的反应原性。

作为本发明的一种优选技术方案，所述胶体金颗粒的制备过程：利用柠檬酸三钠还原法烧制，制备40nm胶体金颗粒。

作为本发明的一种优选技术方案，所述金黄色葡萄球菌蛋白A标记的胶体金颗粒，其制备方法如下：1mL胶体金溶液加2μL 0.2mol/LK₂CO₃调节pH，加入5μg SPA蛋白进行标记，之后用10％BSA进行封闭，离心后弃上清，溶解于10％复溶液中并滴加在金标垫上。