[发明专利]桑树U6启动子及其应用

说明书

本发明公开了一种桑树U6启动子及其应用，所述桑树U6启动子为序列如SEQ ID NO.1所示的启动子Ma01b、序列如SEQ ID NO.2所示的启动子Ma04a、或序列如SEQ ID NO.3所示的启动子Ma04b。本发明首次从垂桑基因组中克隆得到三个桑树U6启动子，发现三个U6启动子都具有转录活性，由启动子Ma01b驱动的重组表达载体的转录活性最高，编辑效率可达11％。本发明中发现的桑树U6启动子对于构建桑树CRISPR/Cas9基因编辑体系，创制优良性状的桑树种质资源具有重要意义。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，更具体地，本发明涉及一种桑树U6启动子及其应用。

背景技术

CRISPR/Cas技术是一种广泛应用的基因编辑技术，其通过sgRNA(single guideRNA)引导特异识别基因组上的靶序列，并切割DNA产生双链断裂(DNA double-strandbreaks,DSBs)，DSBs发生后细胞通过非同源末端连接(non-homologous end joining,NHEJ)和同源重组介导的修复(homologous-directed,repair,HDR)等多种方式进行修复。在修复的过程中，大多数情况下将发生若干核苷酸的缺失或插入，是一种不精确的修改机制。人们因此是利用细胞NHEJ或HDR机制实现定点基因编辑，基因编辑技术已经成为研究基因功能和生物体改造的重要工具。

CRISPR/Cas9系统是最常用的II型CRISPR系统，识别3’端带有NGG的原间隔序列邻近基序(protospacer adjacent motif，PAM)基序，对特异靶序列进行平末端切割。常规的基因编辑体系由具有双链断裂能力的Cas9蛋白和人工融合的sgRNA构成，sgRNA和Cas9的表达水平显著影响基因编辑的效率。Cas9的表达一般由II型RNA聚合酶启动子如CaMV35启动子和植物泛素启动子等驱动，而sgRNA的表达则一般由III型RNA聚合酶启动子(Pol IIIpromoter of small nuclear RNA genes)如U6等启动。

U6启动子具有明确的转录启动位点，识别G开始的高度保守位点，是sgRNA表达的首选，如拟南芥、水稻、小麦、大豆、玉米、棉花、番茄、苹果、金银花等植物均已利用物种本身的U6启动子进行基因编辑。

基因组测序分析表明，物种基因组内存在多个不同的U6基因，其表达水平各不相同，并非所有U6启动子都能驱动基因表达，可见U6启动子的转录效率存在差异。U6启动子的高度保守性使其在不同的物种之间仍具转录活性，比如拟南芥U6启动子能驱动烟草sgRNA的表达，但在同源关系较远的不同物种之间转录活性存在差异。研究表明，物种内源性U6启动子能增加sgRNA表达提高基因编辑效率，如大豆U6启动子Gm6-10的对大豆基因的编辑效率远高于拟南芥AtU6启动子，棉花U6启动子GhU6.3驱动sgRNA的表达量是AtU6的6倍多，编辑效率高4倍多。

桑树是我国的乡土树种，是我国的传统中药。桑树作为一种重要的生态经济型林木，具有重要的经济价值、生态价值和医疗价值，在生态建设、乡村振兴中发挥着重要的功能。随着桑树染色体水平基因组的完成，桑树研究已进入后基因组时代，急需利用基因编辑技术阐明桑树富含脱氧野尻霉素(Deoxynojirimycin，DNJ)、花青素、蛋白质等重要性状的分子机理，创制优质种质资源实现蚕桑产业提质增效。然而，关于桑树U6启动子的研究尚未见报道，严重制约着桑树基因编辑。

发明内容

基于此，本发明的目的在于提供一种桑树U6启动子及其应用。

实现上述发明目的的技术方案包括如下。

本发明的第一方面，提供了一种桑树U6启动子，所述桑树U6启动子为序列如SEQID NO.1所示的启动子Ma01b、序列如SEQ ID NO.2所示的启动子Ma04a、或序列如SEQ IDNO.3所示的启动子Ma04b。

本发明的第二方面，提供了一种重组表达载体，所述重组表达载体携带有上述桑树U6启动子。