[发明专利]一种神经坏死病毒石斑鱼口服疫苗及其制备方法

说明书

本发明公开了一种神经坏死病毒石斑鱼口服疫苗及其制备方法。所述神经坏死病毒石斑鱼口服疫苗的抗原的氨基酸序列如SEQ ID No：1所示。制备方法为：1)重组质粒的构建：合成核苷酸序列如SEQ ID No：1所示的融合基因，将融合基因插入表达载体中获得重组载体，将重组载体转化入原核表达菌，进行培养，筛选出转化成功的原核表达菌；2)将转化成功的原核表达菌诱导表达；3)用诱导表达的原核表达菌饲喂孵化后的卤虫，富集和包裹原核表达菌的卤虫，获得神经坏死病毒感染石斑鱼的药物。本发明的神经坏死病毒石斑鱼口服疫苗，保护率高，对石斑鱼的免疫保护效率达100％。本发明可应用于石斑鱼养殖过程中神经坏死病毒病的防控。

技术领域

本发明属于分子生物学及免疫学领域，具体涉及到一种神经坏死病毒石斑鱼口服疫苗及其制备方法。

背景技术

石斑鱼，是石斑鱼亚科(Epinephelinae)鱼类的总称，其肉质鲜美，有海鸡肉之称。石斑鱼的人工养殖得益于20世纪60年代日本石斑鱼人工繁育的成功。二十世纪八十年代，国内的石斑鱼养殖产业逐渐开始萌芽，海南、广东、福建、广西及浙江沿海逐渐开始石斑鱼的养殖。目前我国养殖的石斑鱼品种较多，其中以斜带石斑鱼(E.coioides)、赤点石斑鱼(E.akaara)等为主。至2016年，石斑鱼人工养殖的年产量已突破10万吨。然而，石斑鱼养殖产业还存在许多问题，如苗种成活率不高，良种覆盖率不高，饲料的精细化程度欠缺，石斑鱼养殖各阶段的病害问题等。

神经坏死病毒(nervous necrosis virus,NNV)属诺达病毒科(Nodaviridae)，β诺达病毒属(Betanodavirus)，神经坏死病毒在石斑鱼幼鱼阶段的危害极其严重。该病毒所诱发的疾病的重要特征是病鱼鳔肿大，在水面螺旋状或旋转游动。感染NNV的鱼苗食欲会变差，且体色变黑，出现在水面上打转或螺旋游动的情况，一周内，鱼苗死亡率就能高达100％。该病也因为其极高的传染性以及对水产养殖造成的巨大危害，现已被国际兽疫组织(OIE)列为重要的鱼类病害之一。因此，如何防治神经坏死病毒病已成为当今石斑鱼养殖业急需解决的重要问题。

关于NNV的免疫和防治，疫苗和有效药物的使用是两种重要的防治手段。目前针对鱼类神经坏死病毒已有灭活疫苗成功的报道了，如对亲鱼进行免疫，在受精卵中确实检测到病毒抗体存在；在对褐点石斑鱼的免疫实验中也取得了67％免疫效果。当然NNV口服疫苗也有不错的保护率，有研究在烟草叶绿体中表达了NNV外壳蛋白，并将其作为口服疫苗在鱼类中诱导免疫，经口服疫苗免疫的鱼类受到部分保护。

鱼用口服疫苗的研究应用，主要是通过设计使主要生物活性物质绕过酶解，直接被后肠吸收，从而增强免疫效果。口服疫苗不仅有效避免了由于注射引起的应激反应，而且可以减少注射及人工成本，在养殖生产中具有推广意义。对于鱼用口服疫苗的研究虽然取得了一些成绩，但还有一系列问题没有完全解决，如怎样更好地保持疫苗的抗原性，口服免疫的具体机理，怎样建立有效的口服传递系统等。

口服免疫的效果受胃肠黏膜系统的吸收及抗原呈递细胞对抗原呈递效率的影响。一般认为，口服免疫效果不如肛门灌注，是因为抗原在胃和前肠道被消化掉，没有足够的抗原能够到达后肠。因此，研究者们纷纷采用新的技术与方法用于保护疫苗抵抗胃酸及各种消化酶的破坏，同时使抗原物质能够缓慢而持久地释放，以便达到更好的免疫效果。目前，口服疫苗的来源主要分为缓释微胶囊、工程微生物、转基因植物及转基因动物。

虽然关于NNV的口服疫苗有一些进展，但还是缺少能投入生产使用且确实有效的疫苗和药物。

发明内容

本发明的目的是提供一种简单方便、成本较低、稳定性高、方便保存，且免疫保护效率高的神经坏死病毒石斑鱼口服疫苗及其制备方法。

本发明的第一个目的是提供一种神经坏死病毒石斑鱼口服疫苗，所述神经坏死病毒石斑鱼口服疫苗的抗原蛋白的编码核苷酸序列如SEQ ID No：1所示。