[发明专利]增强5’-胞苷酸积累的方法及应用

说明书

本发明公开了增强5’‑胞苷酸积累的方法及应用，属于基因工程和微生物工程领域。本发明通过敲除ppnN、ushA、yrfG、yjjG、umpH、umpG基因，过量表达5’‑CTP二磷酸水解酶基因nudG，乳清酸磷酸核糖转移酶基因pyrE，整合表达尿苷酸激酶突变体基因PyrH(R92G/D93G)，并进一步敲除胞苷脱氨酶基因cdd、核糖核苷三磷酸还原酶基因nrdD，整合表达尿苷‑胞苷激酶基因udk、磷酸核糖焦磷酸合成酶基因prs、葡萄糖‑6‑磷酸脱氢酶基因zwf和6‑磷酸葡糖酸脱氢酶基因，提高大肠杆菌的5’‑胞苷酸积累能力。在不添加任何抗生素和诱导剂的条件下，重组菌在60L发酵罐中5’‑胞苷酸产量达到39.6g/L。

技术领域

本发明涉及增强5’-胞苷酸积累的方法及应用，属于基因工程和微生物工程领域。

背景技术

核苷酸主要参与构成核酸，且具有重要的生物学功能。核苷酸及其衍生物可广泛应用于农业生产、食品、医药等领域。化学法合成核苷酸通常以三氯氧磷为磷酸供体，将核苷直接磷酸化生产相应核苷酸。但此种化学法用于合成5’-胞苷酸时，需要在核糖的2’,3’-羟基上加上保护基团，再进行磷酸化反应。化学法合成核苷酸操作步骤多、路线长、立体选择性差、试剂昂贵且试剂有毒、可操作性差、生产成本高，不适合大规模绿色生产。

核糖核酸(RNA)降解也可以用于生产5’-胞苷酸(5’-CMP)，这种方法可以一次获得4种产物，除了5’-胞苷酸外，其他三种均为反应的副产物，需要经过进一步的分离纯化才能获得纯的5’-胞苷酸。同时，作为降解的原料-RNA，也存在诸多限制，如RNA的来源并不广泛，而且该降解RNA生产5’-胞苷酸工艺中的分离操作复杂，目标产物收率降低。

CN 111269870 A披露了一种高产胞苷酸的重组大肠杆菌及其应用，从胞苷酸生产菌株中克隆得到的胞苷激酶基因，重组菌经破碎后得到的粗酶液有着良好的催化活性和稳定性，加入胞苷、三磷酸腺苷(ATP)以及Mg²⁺，反应得到胞苷酸。但，该方法需要对重组菌进行破碎、再对酶进行分离，且产量不高。CN 202111280840.4披露了一种生产5’-胞苷酸的方法，基因敲除技术对大肠杆菌的胞苷单磷酸焦磷酸化酶基因ushA和核苷酸5'-单磷酸核苷酶基因ppnN进行敲除，并通过过量表达尿苷激酶基因udk，获得可积累5’-胞苷酸(5’-CMP)的大肠杆菌突变体。但，上述重组菌株积累5’-CMP时需要诱导剂IPTG和抗生素的补加，该诱导剂和抗生素价格昂贵且对细胞有毒性，同时如果5’-胞苷酸(5’-CMP)的积累浓度进一步获得提高，将进一步促进其工业化生产。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种可在不添加诱导剂和抗生素的条件下高产5’-胞苷酸的重组菌株。

本发明提供了一种重组大肠杆菌，敲除了基因组上的核苷酸5'-单磷酸核苷酶基因ppnN，胞苷单磷酸焦磷酸化酶基因ushA、嘌呤核苷酸酶基因yrfG、嘧啶5’-核苷酸酶基因yjjG、UMP磷酸酶基因umpH和5’-核苷酸酶基因umpG。

在一种实施方式中，所述5'-单磷酸核苷酶基因ppnN的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述胞苷单磷酸焦磷酸化酶基因ushA的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述嘌呤核苷酸酶基因yrfG的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述嘧啶5’-核苷酸酶基因yjjG的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；所述UMP磷酸酶基因umpH的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；所述5’-核苷酸酶基因umpG的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。

在一种实施方式中，所述重组大肠杆菌还表达了5’-CTP二磷酸水解酶；所述5’-CTP二磷酸水解酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示。

在一种实施方式中，所述重组大肠杆菌还表达了乳清酸磷酸核糖转移酶。

在一种实施方式中，所述乳清酸磷酸核糖转移酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.10或SEQ ID NO.12所示。