[发明专利]一种果生炭疽菌RPA检测引物及其应用

说明书

本发明涉及植物病害检测技术领域，具体涉及一种果生炭疽菌RPA检测的特异性引物及其应用。本发明通过引物设计获得了针对果生炭疽菌RPA检测的特异性引物，并且建立了基于RPA的检测体系、试剂、试剂盒。本发明的果生炭疽菌RPA检测体系与其他常见病原菌均无交叉反应，特异性强，检测灵敏度达到10pg/μL，不需要PCR仪等热循环设备，操作简单，尤其适合在基层或者实验条件不足的实验室进行果生炭疽菌的快速检测，对果生炭疽菌的早期检测和口岸检验检疫具有重要的现实意义。

技术领域

本发明涉及植物病害检测技术领域，具体涉及一种果生炭疽菌RPA检测的特异性引物及其应用。

背景技术

果生炭疽菌(Colletotrichumfructicola)是一种常见的致病菌，在咖啡属、柑橘属、梨属、杧果属、苹果属和山茶属等多种植物上被报道，且具有广泛的地域和物种多样性，在世界范围内均有危害报道。仅仅依赖形态学特征或者是PCR分子检测、单基因构建系统发育树等方法均很难对其进行准确鉴定，而采用传统的植物病害检测方法直接观察，会遗漏发病初期未表现出症状的情况，且易受到人为因素和环境条件的干扰，加之耗时长，程序繁琐，需要专业技术人员和仪器设备，并不适合快速检测的要求。CN202010673672.4公开了一种果生炭疽菌特异性基因序列及其应用，其通过基因组聚类分析获得果生炭疽菌的特异性序列，进而设计了引物进行PCR扩增检测，但是该方法需要专业设备，检测速度慢，检测的灵敏度不高。因此，研究快速简便的检测方法对果生炭疽菌的早期检测和口岸检验检疫具有现实意义。

重组酶聚合酶扩增(Recombinase polymerase amplification，RPA)技术是一种在恒温条件下短时反应就可以扩增出检测产物的新型恒温扩增技术，具有反应快速、灵敏性好、特异性高等特点，且不需要昂贵的变温实验仪器，被认为是一种可以替代PCR的新型核酸扩增技术，该技术的关键在于特异性引物的设计，目前对于果生炭疽菌的RPA检测方法尚未见报道。

发明内容

本发明的目的是针对果生炭疽菌(Colletotrichum fructicola)的RPA快速检测的问题，提供一种针对果生炭疽菌RPA检测的特异性引物，所述特异性引物的核苷酸序列为：

上游引物SEQ ID NO.1：5’-CGATTGTGAGTGAGCCCTAGTGGCGAGCCT-3’，

下游引物SEQ ID NO.2：5’-CTTCGTATTTGTGGGAGTTGATTCGGGACT-3’。

本发明的一个方面提供了一种果生炭疽菌RPA检测试剂，所述检测试剂含有上述的特异性引物SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2。所述试剂可以制备液体、冻干粉等制剂形式，试剂中还可以包括多种类型的其他试剂，例如植物总核酸的提取试剂、RPA反应所需的其他试剂。

本发明的另一方面提供了一种果生炭疽菌RPA检测试剂盒，含有上述的特异性引物。

所述果生炭疽菌RPA检测试剂盒，还含有植物总核酸提取试剂盒、RPA扩增反应试剂、阳性对照。

本发明的又一方面提供了一种果生炭疽菌RPA检测的方法，包括如下步骤：

1)提取待测样品基因组DNA；

2)利用提取的样品基因组DNA进行RPA反应，所用特异性引物为权利要求1中所述的特异性引物；

3)RPA反应完成后对反应产物进行检测，检测到目标扩增对象的即为阳性样品。

在上述方法中，RPA反应的反应体系包含：RPA扩增反应试剂，特异性引物，样品基因组DNA。

在上述方法中，RPA反应条件为：反应温度为42℃，反应时间为30分钟。