[发明专利]松果菊苷通过Nrf2/DRP1通路抑制胶原诱导性关节炎中的应用方法

权利要求书

1.松果菊苷通过Nrf2/DRP1通路抑制胶原诱导性关节炎中的应用方法，其特征在于：包括以下步骤：(1)、将7周龄的雄性DBA/1小鼠安置在SPF环境中，最初，小鼠经皮下注射200μg牛型Ⅱ胶原蛋白免疫，第21天，在同一部位皮内再次注射200μg牛型Ⅱ胶原蛋白增强免疫，第28天，小鼠随机分组，每隔一天腹腔注射1％DMSO或0.6mg ECH，持续1个月；

(2)、通过ECH注射治疗后，每隔一天定期监测小鼠的关节炎临床症状和足部炎症的状态变化，第60天处死小鼠，采集全膝关节组织样本，随后，组织标本在10％福尔马林中固定，过夜，并在石蜡中包埋，然后用苏木精伊红和甲苯胺蓝染色，制成小鼠滑膜组织标本并组织病理学分析评估软骨损伤和骨侵蚀；

(3)、将小鼠滑膜组织标本在4℃戊二醛固定2小时，然后取出在室温下1％柠檬酸-0.1mol/L磷酸缓冲液中固定2小时，在包埋前，将组织标本脱水，用2％醋酸铀酰和柠檬酸铅双染超薄切片，直接用透射电镜观察；

(4)、用福尔马林固定的石蜡包埋滑膜组织切片在脱蜡液中脱蜡，用分级乙醇溶液再水化，用3％H2O2封闭10分钟，在用5％BSA阻断非特异性结合位点，切片分别用Anti-Drp1抗体(1:200)，Anti-IL-6抗体(1:200)，Anti-NLRP3抗体(1:100)在4℃下孵育过夜，随后，切片用二抗HRP山羊抗兔IgG抗体(1:2000)孵育，在室温下放置1小时，使用倒置荧光显微镜获得图像；

(5)、将获得的滑膜组织标本均质，用TRIzol试剂提取总RNA，每个RNA样本中总共2μg被反转录为cDNA，RT-qpcrPCR分析使用SYBR Green PCR试剂盒和Rotor-Gene Q RT-PCR仪扩增2μg cDNA样本，循环参数为95℃10min,，95℃15sec,，60℃60sec循环40次，用2-△△Ct法计算目的基因的变化；

(6)、采集小鼠血液样本，室温凝固2小时，获得血清，血清IL-6和IL-1β水平使用酶联免疫吸附测定试剂盒，最后，用酶标仪测量450nm处的吸光度；

(7)、另取小鼠滑膜组织标本进行均质，采用BCA蛋白测定试剂盒测定总蛋白浓度，分别使用MDA和还原型谷胱甘肽含量检测试剂盒测定MDA和谷胱甘肽的表达，随后，用酶标仪测量412nm处的吸光度。结果根据前面描述的方法进行分析；

(8)、使用ROS荧光探针-DHE测定滑膜切片中的ROS含量，在用无血清培养基将DHE稀释至最终浓度20μM，然后，细胞悬液用DHE在37℃黑暗环境下孵育30分钟，再用DAPI染色，用倒置荧光显微镜观察荧光信号；

(9)、免疫荧光法检测Nrf2核转位和Keap1表达，滑膜切片用4％多聚甲醛固定30分钟，并在室温下使用封闭液封闭1小时。洗涤后，用Anti-Nrf2抗体和Anti-Keap1抗体(在4℃孵育过夜，孵育2h后用cy3偶联二抗(1:500)染色，细胞核用DAPI染色，用倒置荧光显微镜观察荧光信号；

(10)、数据采用SPSS统计软件进行分析，数据以平均值±标准差表示。组间比较采用Student's t检验，P0.05为差异有统计学意义。

2.根据权利要求1所述的松果菊苷通过Nrf2/DRP1通路抑制胶原诱导性关节炎中的应用方法，其特征在于：步骤3中的超薄切片为50-70nm。

3.根据权利要求1所述的松果菊苷通过Nrf2/DRP1通路抑制胶原诱导性关节炎中的应用方法，其特征在于：步骤9中中的封闭液为Triton X-100和5％BSA。