[发明专利]一种敲除PSME3基因的人软骨肉瘤细胞株及其构建方法

权利要求书

1.一种敲除PSME3基因的人软骨肉瘤细胞株，其特征在于，所述人软骨肉瘤细胞株为HCS2/8-PSME3KO，保藏编号为CCTCC NO：C202309，保藏日期为2023年01月07日，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏单位地址为湖北省武汉市武昌区武汉大学保藏中心(武汉大学第一附属小学对面)。

2.一种如权利要求1所述人软骨肉瘤细胞株的构建方法，其特征在于，步骤包括：

S1、根据人软骨肉瘤细胞株HCS2/8中PSME3基因的编码序列设计并合成sgRNA序列；

S2、将步骤S1合成的所述sgRNA序列同源重组至第一载体中，将所述第一载体线性化后，体外转录以获得所述sgRNA序列的RNA序列；

将含有Cas9基因的第二载体线性化后，体外转录以获得Cas9基因的mRNA序列；

S3、分别将步骤S2中获得的所述sgRNA序列的所述RNA序列以及所述Cas9基因的所述mRNA序列转染至人软骨肉瘤细胞株HCS2/8中，将所述转染后的人软骨肉瘤细胞株HCS2/8单克隆培养后，即得所述人软骨肉瘤细胞株。

3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，步骤S1中，所述sgRNA序列的靶序列如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示。

4.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，步骤S2中，所述第一载体为T载体。

5.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，步骤S3中，所述Cas9基因的所述mRNA序列与所述sgRNA序列的所述RNA序列的质量比为(4-6)：1。

6.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，步骤S3中，所述转染采用电击转染法。

7.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，步骤S3中，所述单克隆培养采用有限稀释法；所述有限稀释法中铺板细胞的密度为0.3-0.5个细胞/孔。

8.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，步骤S3中，还包括：在所述单克隆培养后进行PCR鉴定。

9.根据权利要求8所述的构建方法，其特征在于，所述PCR鉴定中采用的引物序列包括：第一区域引物、第二区域引物以及第三区域引物。

10.根据权利要求9所述的构建方法，其特征在于，所述第一区域引物的上游引物如SEQID NO：3所示，所述第一区域引物的下游引物如SEQ ID NO：4所示；所述第二区域引物的上游引物如SEQ ID NO：5所示，所述第二区域引物的下游引物如SEQ ID NO：6所示；所述第三区域引物的上游引物如SEQ ID NO：7所示，所述第三区域引物的下游引物如SEQ ID NO：8所示。