[发明专利]一种NK细胞冻存液及其冻存方法和应用

说明书

本发明公开了一种NK细胞冻存液及其冻存方法和应用，涉及生物医学技术领域。所述的NK细胞冻存液由CS10和人血清白蛋白组成；所述的CS10和人血清白蛋白的体积比为(1‑5)：1。本发明还提供了一种NK细胞的冻存方法，所述的冻存方法包括以下步骤：(1)将CS10和人血清白蛋白按照体积比进行混合，得NK细胞冻存液；(2)向NK细胞中加入NK细胞冻存液，得细胞悬液；(3)将细胞悬液分装于冻存管中并进行程序降温。本发明的冻存液的成分简单，稳定性好，提高了细胞复苏后的活率，减少了冻存过程中对NK造成的损伤。

技术领域

本发明涉及生物医学技术领域，具体涉及一种NK细胞冻存液及其冻存方法和应用。

背景技术

嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor，CAR)是基于基因工程构造并表达于细胞表面的受体蛋白，由抗原识别区、铰链区、跨膜区和胞内信号转导区组成。自然杀伤细胞(Natural killer cells，NK cells)是人类先天免疫淋巴细胞，细胞表面含有一系列激活和抑制受体，可以快速识别并杀伤病变细胞。CAR-NK疗法是基于基因工程改造的NK细胞的过继细胞疗法。其疗法能规避自体CAR-T的许多缺点，如细胞因子释放综合征、与免疫相关的神经毒性综合征、可及性差等。CAR-NK细胞制剂辅料的选择尤为重要，NK细胞的冻存与T细胞相比，一般损伤较大，需筛选合适的制剂处方，保证较好的活性。

CS10是一款无血清、无动物成分的冻存液，DMSO含量为10％。该冻存液已广泛应用于免疫细胞冻存，且有较好的冻存保护效果。FDA批准的第3款CD19导向CAR-T细胞疗法Breyanzi，其制剂所用的处方为CS10，24％复方电解质，1％HSA。

DMSO Free GMP grade为GMP级完全冻存液，其为无色透明澄清液体，不含DMSO、血清及动物源成分，化学成分限定且安全。并已取得美国FDA的BMF(Biological Master File)登记号(MF#：19364)。该冻存液已显示出较好的冻存效果。

中国专利CN202211407542.1中公开了一种NK细胞冻存液及冻存方法，所述的NK细胞冻存液由冻存液A和冻存液B组成；所述的冻存液A包括以下体积百分比的组分：人血清白蛋白30-60％、右旋糖酐10-30％和海藻糖25-45％；所述的冻存液B包括以下组分：忍冬提取物5-10％、551-H3培养基45-50％、培养上清浓缩液4-6％、羟乙基淀粉18-20％和甘油21-25％。该发明的NK细胞冻存液添加培养上清浓缩液，能够维持细胞冻存中和复苏后的细胞活性，无添加异源蛋白，避免外源蛋白给细胞带来的污染，同时将生物废料加以应用，大大节省了冻存成本。但是该NK细胞冻存液的组成成分复杂。

中国专利CN202010240894.7中公开了一种NK细胞冻存液，所述的NK细胞冻存液是在培养基中添加葡萄聚糖和多聚赖氨酸CPLL制成。该发明的NK细胞冻存液不包括动物和人源血清，防止了人畜共患传染病的潜在传播或引起同种异体反应的风险；加入的葡聚糖和CPLL不仅能减少冻存和复苏过程中冰晶对细胞的损伤，还能有效的保存细胞的杀伤活性。该发明的冻存液制备简单，安全，有很好的应用市场，但其复苏后细胞活率的下降幅度较大。

发明内容

本发明的目的是提供一种NK细胞冻存液，本发明通过对NK细胞冻存液中各成分的种类及含量进行筛选，使得制备的NK细胞冻存液能够有效的保护细胞免受损伤，并且在冻存和复苏过程中维持细胞的活性。

术语解释：

如本文所述，术语NK细胞又称为自然杀伤细胞，是人类先天免疫淋巴细胞。NK细胞具有抗病毒的作用，在其机体受到病毒感染时，不需要抗原刺激，就可以产生细胞因子、白细胞介素和干扰素等，对抗肿瘤的发生和病毒感染。NK细胞在肿瘤中起到很好的监视作用，会监视人体免疫寿命和肿瘤细胞的损伤情况等。NK细胞还能够调解人体免疫功能，防止产生自身免疫性疾病以及其他免疫功能的异常。