[发明专利]一种用于对有毒蘑菇进行种鉴定的引物组和PCR检测方法

权利要求书

1.一种用于对有毒蘑菇进行种鉴定的引物组，其特征在于：包括用于对有毒蘑菇进行PCR分子鉴定的特异性引物组，所述有毒蘑菇包括选自爪哇鹅膏菌、异味鹅膏、肉褐鳞环柄菇、栎裸柄伞中的一种或多种；

所述有毒蘑菇对应的特异性引物如下表所列：

2.根据权利要求1所述的引物组，其特征在于：还包括用于实时荧光PCR的特异性TaqMan探针，每种有毒蘑菇对应的TaqMan探针如下表所示：

。

3.一种用于对有毒蘑菇进行种鉴定的试剂盒，其特征在于：包括权利要求1所述的引物组，和PCR扩增反应所需的试剂；优选所述PCR为常规PCR或者实时荧光PCR或者数字PCR；优选所述PCR扩增反应所需的试剂为DNA聚合酶和DNA聚合酶缓冲液。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于：还包括DNA提取试剂、阳性对照和阴性对照。

5.一种鉴定有毒蘑菇的常规PCR方法，其特征在于，所述有毒蘑菇包括选自爪哇鹅膏菌、异味鹅膏、栎裸柄伞、肉褐鳞环柄菇中的一种或多种；

包括如下步骤：

1)提取待测样品的基因组DNA；

2)采用权利要求1所述的引物组中的特异性引物对提取的基因组DNA进行PCR扩增；

3)检测PCR扩增产物中是否含有目的扩增片段，含有对应目的扩增片段的样品鉴定为相应种类的有毒蘑菇；

爪哇鹅膏菌对应的扩增片段大小为410bp，

异味鹅膏对应的扩增片段大小为290bp，

栎裸柄伞对应的扩增片段大小为280bp，

肉褐鳞环柄菇对应的扩增片段大小为280bp。

6.根据权利要求5所述的常规PCR方法，其特征在于：

PCR反应体系为：总体积25μL，含有：2×Taq PCR Master mix 12.5μL，浓度均为10μM的上下游引物各1μL，DNA模板1μL，余量为ddH₂O；

爪哇鹅膏菌PCR扩增程序为：94℃3min；94℃30s，60℃30s，72℃30s，30循环；72℃10min；

异味鹅膏PCR扩增程序为：94℃3min；94℃30s，65℃30s，72℃30s，30循环；72℃10min；

栎裸柄伞PCR扩增程序为：94℃3min；94℃30s，60℃30s，72℃30s，30循环；72℃10min；

肉褐鳞环柄菇PCR扩增程序为：94℃3min；94℃30s，60℃30s，72℃30s，30循环；72℃10min；

优选所述步骤3)中采用琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物中是否含有目的条带；

优选地，可检测的模板浓度可低至10^-5ng/μl。

7.一种鉴定有毒蘑菇的实时荧光PCR方法，其特征在于，所述有毒蘑菇包括选自爪哇鹅膏菌、异味鹅膏、栎裸柄伞、肉褐鳞环柄菇中的一种或多种；

包括如下步骤：

1)提取待测样品的基因组DNA；

2)采用权利要求2所述的引物组对提取的基因组DNA进行实时荧光PCR扩增，根据扩增结果判断待测对象是否为对应种类的有毒蘑菇，如果Ct≤30则判断为对应种类的有毒蘑菇阳性。

8.根据权利要求7所述的实时荧光PCR方法，其特征在于：

所述实时荧光PCR的反应体系为：总体系20μL，含有2×Premix Ex Taq 10μl，浓度为10μmol/L的上下游引物各1μl，浓度为10μmol/L的探针0.5μl，ddH₂O 6.5μl，DNA模板1μl；

其中，爪哇鹅膏菌、异味鹅膏、栎裸柄伞的qPCR扩增程序为：95℃10min；95℃10s，60℃40s，40个循环；

肉褐鳞环柄菇的qPCR扩增程序为：95℃10min；95℃10s，65℃40s，40个循环；

优选地，可检测的模板浓度可低至10^-5ng/μl。