[发明专利]一种米曲霉工程菌、构建方法及应用

说明书

本发明涉及羊毛甾醇的制备技术领域，公开了一种米曲霉工程菌，所述米曲霉工程菌体内携有表达质粒pRA‑HMGR‑GLLS，其中：HMGR为3‑羟基‑3‑甲基戊二酰辅酶A还原酶编码基因片段，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；GLLS为羊毛甾醇合酶编码基因片段，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明的米曲霉工程菌株可以大米为底物发酵，生产羊毛甾醇，羊毛甾醇产量超过189 mg/1Kg大米，培养周期短、分离纯化简单易行，非常适合大规模发酵生产，可为含有羊毛甾醇骨架结构的天然产物以及相关医药中间体的合成提供充足的原料。

技术领域

本发明涉及羊毛甾醇的制备技术领域，具体涉及一种可用大米生产羊毛甾醇的米曲霉工程菌、构建方法及应用。

背景技术

羊毛甾醇属于四环三萜类化合物，在预防和治疗白内障方面发挥至关重要的作用，是一种新型的白内障预防和治疗策略。同时，它还是灵芝酸、麦角甾醇及具有多种生物活性三萜类化合物的前体。因此，羊毛甾醇在临床药物开发和三萜类天然化合物生物合成机制过程的研究中，具有十分重要的地位和作用。

目前，市售的高纯度羊毛甾醇(97％以上)售价高达10～20万元/g，高昂的价格阻碍了羊毛甾醇的相关研究及应用。现有羊毛甾醇多为以链状的角鲨烯为原料通过化学合成方法的制备，存在纯度低、收率低及合成工艺复杂的问题。中国专利申请202210527268.5，专利名称“代谢工程方法、产羊毛甾醇工程菌及其构建方法、应用”，公开了将酿酒酵母改造为生产羊毛甾醇工程菌株，将其接种至发酵培养基中发酵培养制备羊毛甾醇的技术方案。但是，该技术方案中所用发酵培养基为酵母缺陷型SD-URA-MET-LEU培养基，可能面临培养基来源窄、羊毛甾醇产量不高等问题。

发明内容

针对商业化羊毛甾醇售价高，而传统制备方法存在收率低等问题，本发明的目的在于提供一种可用大米生产羊毛甾醇的米曲霉工程菌，可以大米为底物高效发酵制备羊毛甾醇，羊毛甾醇产量可以达到189mg/1kg大米。

本发明提供如下的技术方案：

一种米曲霉工程菌，所述米曲霉工程菌体内携有表达质粒pRA-HMGR-GLLS，其中：HMGR为3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶编码基因片段，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；GLLS为羊毛甾醇合酶编码基因片段，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明以米曲霉为出发菌株构建米曲霉工程菌，米曲霉具有高效分解淀粉的能力，所用的表达质粒pRA-HMGR-GLLS上携带pAmyB淀粉酶启动子，以大米为培养基时可以高效驱动羊毛甾醇合酶编码基因GLLS的高效表达。

上述米曲霉工程菌的构建方法，包括以下步骤：

(1)表达质粒pRA-HMGR-GLLS的构建；

(1-1)以燕麦的cDNA为模板，以P1F为正向引物、P1R为反向引物，核苷酸序列分别如SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4所示，扩增获得3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶编码基因HMGR的片段；

(1-2)以pRA质粒经NheI酶切线性化处理的片段为载体，将3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶编码基因HMGR的片段插入到pRA质粒中，获得表达质粒pRA-HMGR；

(1-3)以灵芝的cDNA为模板，以P2F为正向引物、P2R为反向引物，核苷酸序列分别如SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6所示，扩增获得羊毛甾醇合酶编码基因GLLS的片段；

(1-4)以pRA-HMGR质粒经KpnI酶切线性化处理的片段为载体，将羊毛甾醇合酶编码基因GLLS的片段插入到pRA-HMGR质粒中，获得表达质粒pRA-HMGR-GLLS；

(2)制备米曲霉工程菌株(A.oryzae/pRA-HMGR-GLLS)；