[发明专利]一种酶响应快速降解的大孔水凝胶及其制备方法和应用

说明书

本发明公开了一种酶响应快速降解的大孔水凝胶及其制备方法和应用，本发明中基于葡聚糖和聚乙二醇液液相分离制备的大孔水凝胶可以响应烟草蚀纹病毒蛋白酶，在烟草蚀纹病毒蛋白酶溶液中可以快速降解。本发明中的酶响应快速降解的大孔水凝胶可以广泛应用于细胞培养，增殖，迁移，分化和收集，尤其适用于间充质干细胞的扩增，并且经烟草蚀纹病毒蛋白酶介导的水凝胶降解收获的扩增后间充质干细胞为具有高干性维持、功能增强、高度保留细胞外基质的间充质干细胞球。

技术领域

本发明涉及新材料领域，尤其是一种酶响应快速降解的大孔水凝胶及其制备方法和应用。

背景技术

间充质干细胞具有细胞来源广泛、分化潜能高、生长速度快等优良特性，广泛应用于组织工程、干细胞治疗、药物筛选和个体化疾病模型。这些应用往往要求足够数量和高质量的间充质干细胞以获得预期的效果。常用的二维扩增方法通常会造成间充质干细胞失去干性和改变表型，因而导致下游应用结果不理想。相比之下，间充质干细胞在三维培养中表现出更强的多方面特征。三维培养可大致分为无支架三维培养和基于水凝胶支架的三维培养。

无支架三维培养间充质干细胞的常用方法包括悬滴、低附着表面、磁悬浮、旋转瓶、旋转壁容器等。在这些方法种，间充质干细胞通过细胞与细胞间的相互结合作用聚集成间充质干细胞球。间充质干细胞球相对于单个间充质干细胞悬液具有多方面的优势，表现为干性增强，活性增强，以及旁分泌免疫调节和营养作用增强（抗凋亡、血管生成、抗纤维化和抗炎）等效益。然而，这些方法存在的最显着的缺点之一则是这些细胞由于缺少初始细胞外基质结合而造成失巢凋亡，导致一部分细胞在培养过程中丧失活性。

体内的间充质干细胞被其分泌的细胞外基质壁龛包围，这样一种壁龛结构可以维持间充质干细胞的干性、多分化潜能和存活，并使间充质干细胞能够有效地响应分化刺激。因此细胞外基质被认为在干细胞的三维培养中具有十分重要的作用。基于此，模拟细胞外基质的水凝胶支架已广泛用于组织工程。例如，短肽精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（下文缩写为RGD）是一种由细胞外基质蛋白衍生的细胞粘附短肽，在水凝胶网络中的共价连接RGD，为细胞锚定于水凝胶支架上提供初始结合位点，很好的解决了细胞无法粘附于人工合成水凝胶而导致的失巢凋亡的问题。这些应用说明了细胞外基质在水凝胶制造方面举足轻重。然而，天然细胞外基质生态位是一个复杂的蛋白质和多糖网络，充当渗透于其中的细胞信号分子（如生长因子和基质碎片）的“港湾”，使得这些分子可以释放回细胞以调节细胞的功能和活动。形成这样的天然细胞外基质生态位需要依赖于细胞外基质蛋白的分泌后组装。这也直接决定了其不可替代性，同时也是制约人工细胞外基质在组织工程中应用的一个重要因素。

间充质干细胞在水凝胶支架内扩增时分泌细胞外基质，重塑水凝胶网络以进一步增殖和迁移。因此，在水凝胶内部的间充质干细胞的增殖和细胞外基质的增殖是两个同时发生的事件。然而，基于支架的间充质干细胞的长期扩增的两大缺点在于：增殖空间有限难以实现宏量扩增，以及缺乏适当的方法以确保收获到高质量的间充质干细胞。实际上，在扩增间充质干细胞的收获过程中，保留细胞增殖期间分泌的天然细胞外基质这一重要因素也很难实现。这些原因均大大影响了间充质干细胞的下游应用，使得这些应用的结果无法达到预期水平。为此，结合无支架和基于水凝胶支架技术两者优势的新型材料已被提名为组织工程的创新和强大工具，迫切需要突破以解决关键问题。

因此，针对增殖空间和收获方法方面存在的受限因素，申请人希望利用大孔水凝胶结合无支架和基于支架的培养优势解决增殖空间受限的问题；同时，引入烟草蚀纹病毒蛋白酶及其底物序列介导水凝胶的快速降解以实现水凝胶内部细胞的快速释放。由此，解决间充质干细胞三维扩增技术领域的这两大经典痛点难题。

发明内容

本发明所要解决的问题是，针对上述间充质干细胞三维扩增技术中存在的两大难题，提出创新方案，利用大孔水凝胶的空间大的优势以及烟草蚀纹病毒蛋白酶的高效酶切活性的性质，设计出可以一种条件温和、快速响应降解的大孔水凝胶。