[发明专利]一种用于十字花科植物转基因的改良蘸花法及其应用

权利要求书

1.一种用于十字花科植物转基因的改良蘸花法，其特征在于：包括以下步骤：

(1)选用盛花期十字花科植物，所述十字花科植物为拟南芥、白菜型油菜、甘蓝型油菜等、任何含有目的基因的重组二元载体、农杆菌GV3101作为实验对象；

(2)摇菌：将前期测序验证正确的重组质粒转化农杆菌GV3101，涂布在含有选择抗生素的YEB固体培养基上，28℃培养箱倒置培养48～72h，挑取单克隆在5mL YEB液体培养基(含相应载体选择抗生素)的试管中，28℃、200rpm摇菌24h，之后转50mL YEB液体培养基(含载体选择抗生素：Kana的浓度为100μg/mL，Rif的浓度为50μg/mL)进行28℃、200rpm大摇，摇菌至OD600＝0.8～1.2；

(3)农杆菌重悬：将培养好的农杆菌菌液分装于50mL离心管中，配平后在室温下以5000rpm转速离心10分钟，富集农杆菌菌体，弃去上清液；用新配制的重悬液对50mL离心管中沉淀的菌体进行重悬，并用新配制的重悬液调整农杆菌重悬液浓度至OD600＝0.8～1.0；

(4)侵染：将已处理过的拟南芥、白菜型油菜、甘蓝型油菜等的花序倒置浸没在农杆菌重悬液进行轻微晃动浸染15～30s，然后稍喷洒些无菌水保湿，并用一次性手套覆盖，黑暗培养24h，然后去除黑暗和一次性手套后，即可正常培养。为提高侵染效率，2～3天后可以重复侵染一次；

(5)侵染后管理：花序开花正常时(侵染2～3天后)；每天查看已侵染花序，可用同菌株已侵染花序适当碰触授粉，以提高种子结荚率，结荚后，尽量减少浇水量，两到三周浇一次水即可；

(6)筛选鉴定：正常培养植株至收取种子后，在含有筛选抗生素的MS固体培养基上进行筛选，7～21天即可筛选成功，将阳性苗稍炼苗后转至土培培养，土培生长健壮后的材料可根据需要提取DNA、RNA、蛋白等进行下游鉴定分析。

2.如权利要求1所述一种用于十字花科植物转基因的改良蘸花法，其特征在于：所述新配制的重悬液配方为：40ml无菌水+2g蔗糖(5％)+20uL Silwet L-77(0.05％)。

3.如权利要求1所述一种用于十字花科植物转基因的改良蘸花法，其特征在于：所述拟南芥、白菜型油菜、甘蓝型油菜等的花苞处理方法为：实施侵染前，将已结荚果、已盛开花苞和花序内部减数分裂前期的花苞用无菌镊子小心去除。

4.如权利要求1所述一种用于十字花科植物转基因的改良蘸花法，其特征在于：所述筛选鉴定中抗生素的浓度：kana的浓度为50μg/mL，Hyg B的浓度为25～30μg/mL。

5.如权利要求1所述一种用于十字花科植物转基因的改良蘸花法，其特征在于：所述筛选鉴定中抗生素筛选时间为，kana根据情况筛选10～21天；Hyg B根据情况筛选7～10天。

6.如权利要求1所述一种用于十字花科植物转基因的改良蘸花法，其特征在于：所述炼苗，可将培养瓶的盖子适当打开2～3天再移至土培，也可以选择用1/2Hoagland’s营养液进行水培1周生根，再移至土培。

7.如权利要求1-6中任一所述一种用于十字花科植物转基因的改良蘸花法的应用，其特征在于：改良蘸花法可用于转基因植物包含但不限于十字花科植物拟南芥、白菜型油菜、甘蓝型油菜等的应用。