[发明专利]用于土拉弗朗西斯菌的CRISPR-Cas12a检测引物组及其应用

说明书

本发明公开了用于土拉弗朗西斯菌的CRISPR‑Cas12a检测引物组及其应用。本发明提供了一种用于检测土拉弗朗西斯菌的CRISPR‑Cas12a系统，还提供了用于特异性扩增第一方面中所述土拉弗朗西斯菌靶点序列的RAA扩增引物；还提供了作为荧光报告分子的探针；本发明基于土拉弗朗西斯菌及其近缘物种的全基因组比对获取土拉弗朗西斯菌特异性基因序列，进一步利用特异性基因序列设计RAA扩增引物和crRNA序列对土拉弗朗西斯菌进行检测，并开发相关试剂盒。本发明可特异检测土拉弗朗西斯菌，将其与其他近缘物种区分；具有快速、简便、准确的特点。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及用于土拉弗朗西斯菌的CRISPR-Cas12a检测引物组及其应用，更加具体的涉及用于土拉弗朗西斯菌的CRISPR-Cas12a检测引物、crRNA及其用途。

背景技术

土拉热也称土拉菌病，是由土拉弗朗西斯菌(Francisella tularensis)引起的一种人兽共患热性传染疾病，因其最初在野生啮齿动物尤其是野兔中流行，所以也被称为兔热病。土拉弗朗西斯菌属于弗朗西斯菌属，其由四个亚种组成，其中A型和B型是引起人类疾病的主要亚种，A型亚种菌株主要分布于加拿大和美国，其毒力最强，B型菌株几乎遍布于包括欧洲在内的整个北半球，据流行病调查显示，我国目前土拉菌病例均为B型亚种。土拉菌病以体温升高、淋巴结肿大、脾和其他内脏点状坏死变化为特征。临床表现大多起病急，体温升高迅速，伴有头痛、乏力、食欲减退、肌肉疼痛和盗汗，继而病情发展，出现谵妄、昏睡、烦躁不安等急性全身中毒症状。土拉热作为一种自然疫源性人兽共患病，目前在很多地区仍在流行，基于其可以通由气溶胶传播的特性，给防控治疗机构的检验鉴定等工作带来了巨大的困难。土拉菌的传统检验鉴定方法主要有常规分离培养、酶联免疫吸附实验、微量血液凝集试验、胶体金、普通PCR等。分离培养土拉菌是土拉热诊断的金标准，但该菌生长缓慢，营养要求高，不利于诊断。酶联免疫吸附试验(ELISA)和乳胶凝集的免疫学检测方法已经被广泛使用，但与布鲁氏菌(Brucella)存在不同程度的交叉，容易造成误诊。荧光定量PCR和普通PCR灵敏度高，但其需要精密昂贵的检测仪器和良好的实验环境，很难用于基层实验室和现场等地区。

CRISPR-Cas技术是近年来发展迅猛的基因编辑技术，成簇的规律间隔的短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR)及其相关蛋白(CRISPR-associated proteins,Cas)构成CRISPR-Cas系统。CRISPR-Cas系统原本是存在于原核生物体内的一种适应性免疫机制。目前，经过一系列的改造，CRISPR-Cas技术已在基因组编辑、基因表达调控、基因治疗、病原体检测、靶基因高通量筛选、表观遗传修饰等多个生命科学的研究领域被广泛应用。除了作为基因编辑工具，Ⅱ类Cas蛋白如Cas12a蛋白具有的“附属切割”特性，已被开发成识别不同类型靶标的核酸检测方法，在快速检测领域具有重大潜力。

重组酶聚合酶恒温扩增技术(Recombinase Polymerase Amplification，RPA)是一种等温扩增新技术，广泛用于病原菌核酸分子诊断。其在国内基于开发的公司及使用酶来源等的差异，又被命名为重组酶介导等温扩增技术(Recombinase AidedAmplification，RAA，江苏奇天基因生物科技有限公司、杭州众测生物科技有限公司)或酶促恒温扩增技术(Enzymatic Recombinase Amplification，ERA，苏州先达基因科技有限公司)等。RAA用三种核心酶替代了聚合酶链式反应(PCR)所需的热循环。不同于许多其他等温技术，RAA省去了升高或精确控温阶段，扩增反应在25～42℃的温度范围内均可进行，反应通常在5～15min内完成。RAA技术自一出现就崭露头角，因其具有反应迅速(5～15min)、特异性强(引物)、低温运行(25～42℃)、样本容差(对样本类型的要求特别宽松)、灵敏度高(单拷贝)、适用性广、试剂形态灵活(液态试剂或干粉)和检测形式多样等优势，在核酸检测领域得到了广泛应用。