[发明专利]连续生产赤藓酮糖的工艺方法

说明书

本发明公开了一种基于赤藓糖醇与日本葡萄糖酸杆菌发酵体系的连续化与固定化相结合的L‑赤藓酮糖生产工艺方法，采用基于中空纤维过滤系统的灌流培养技术，构建同步分离体系，利用中空纤维过滤系统实现分离与发酵生产同步，并且进行菌体活力复苏，同时再进行菌体固定化，与滤出液中残余的赤藓糖醇反应，降低其浓度。该发明真正意义上实现了全过程赤藓酮糖的连续化生产。降低了过程废弃培养物的量，实现长时间的高细胞密度和长时间高效的连续性生产L‑赤藓酮糖(生产强度大于6g/L*h)，同时降低了底物浓度对产物提纯的影响，简化了后期提纯工作，减少了生产损耗，降低了生产成本，并且提高了产物纯度，从而提升了产品价值。

技术领域

本发明涉及生物转化和微生物发酵领域，具体地说涉及一种连续生产L-赤藓酮糖的工艺方法。

背景技术

L-赤藓酮糖(L-erythrulose,DHB)常温下为淡黄色液体，高纯度(78～85％)的L-赤藓酮糖是黄色粘稠状液体，有甜味，其在自然界存在，但含量极少，属于稀有糖。

L-赤藓酮糖具有生物可降解性，能够食用且没有毒性，其含有酮基，理化性质活跃，能够参与并催化许多反应，因此是化工合成中重要的中间体和多性能添加剂，在食品、化工领域和制药领域应用广泛。

L-赤藓酮糖的生产目前主要以赤藓糖醇为原料，经化学法或生物发酵法获得。以赤藓糖醇为前体的化学合成法，此法比较繁琐，且产物为消旋体手性化合物，拆分困难，不利于纯化。微生物法包括了以赤藓糖醇为底物的微生物发酵法以及静息细胞转化法，其通过发酵过程中的酶促反应，可选择性生成L型产物，且该法具有操作简便，反应条件温和、过程易于控制、原料利用率及产品纯度高、绿色环保等优点。

L-赤藓酮糖生物催化生产的最大的难点在于L-赤藓酮糖难实现结晶，目前市面上主要的产品为浓度大于85％的浓缩液，如何提高L-赤藓酮糖浓缩液的纯度是产业化生产中面临的最大难点，而发酵产物中包含底物赤藓糖醇、菌体蛋白等杂质，过度催化可以降低底物赤藓糖醇浓度，但随之带来的菌体自融破碎会给发酵产物增加菌体蛋白、核酸等杂质；而单纯生物催化连续生产又无法实现底物的充分利用。会导致产物的纯度不佳，同时影响其L-赤藓酮糖的收率，使提纯成本增加。

中国专利CN201410112899.6(公开日2014年07月30日)公开了一种能微生物发酵生产L-赤藓酮糖的菌株HD385。其可利用常规氮源(如牛肉膏、玉米浆、尿素等)和赤藓糖醇等原料生物发酵制备L-赤藓酮糖，经发酵培养获得186.5g/L的L-赤藓酮糖。该工艺的反应体系中含有较多的磷酸钾、碳酸钙，不利于L-赤藓酮糖的纯化，且重复利用率低。

发明内容

在进行L-赤藓酮糖的发酵生产时，我们发现底物赤藓糖醇和产物L-赤藓酮糖的浓度对菌体生长有影响，二者浓度过高时都会抑制菌体活力，同时底物的浓度高低会影响后期L-赤藓酮糖提纯时的纯度。而L-赤藓酮糖的纯度高低会直接影响其价格，纯度越高的产品价格也越高，L-赤藓酮糖提纯工艺一直都是一个研究热点和难点。针对L-赤藓酮糖提纯难度的技术问题，本申请提出一种连续灌流催化和连续固定化细胞催化相偶联的生产方法。

本该方法可实现连续化生物催化和连续化固定化细胞，其可以提高产率，降低产物底物浓度，提高产品纯度。本发明旨在解决现有工艺反应体系复杂、产品纯化困难、生产耗损多等问题。生产L-赤藓酮糖时，我们利用中空纤维过滤系统将L-赤藓酮糖从发酵液中分离出来，从而降低L-赤藓酮糖对菌体的抑制作用，同时严格控制底物赤藓糖醇的浓度。然后利用固定化菌体消耗分离出来的L-赤藓酮糖液体中残余的赤藓糖醇，从而降低了其提纯的难度，提高了产品L-赤藓酮糖的纯度。同时对于发酵后期菌体活力的衰减，我们构建了相应的菌体复苏体系，进行了多次的优化和改进后，确定了最终的体系。该体系和中空纤维过滤系统的联合使用，可以实现连续生产L-赤藓酮糖的目的，同时可以最大限度地降低后续提纯的难度，减少多余的生产耗损，以更低的成本投入去获得更高的收益回报。