[发明专利]一种星油藤叶片细胞来源的原生质体的制备方法与质粒转化方法

权利要求书

1.一种星油藤叶片细胞来源的原生质体的制备方法，其特征在于包括如下步骤：（1）选取正常生长状况下幼嫩的星油藤真叶2片；黑暗条件下，用真空泵抽真空，用锡箔纸包好培养皿，室温放到摇床上以最小幅度，震荡过夜裂解；

（2）在显微镜下检查原生质体释放情况，观察到较多单个细胞即可停止酶裂解反应，向原生质体酶解液中加入等体积4 ℃ 预冷的W5溶液，所述的原生质体酶解液与W5溶液的体积比为1：1；

（3）用W5溶液润湿100目筛网，将原生质体酶解液过滤到50mL圆底离心管，离心机调到soft模式，22℃，100g离心5min，去除上清液，用10ml W5溶液轻柔地重悬原生质体，冰上静置待原生质体自然沉降。

2.根据权利要求1所述的星油藤叶片细胞来源的原生质体的制备方法，其特征在于：在步骤（1）中，植株上最新展开且面积未超过子叶的幼嫩叶片，用刀片小心把叶片切成小于1mm细叶条，尽量去掉叶脉组织。

3.根据权利要求1所述的星油藤叶片细胞来源的原生质体的制备方法，其特征在于：在步骤（1）中，切好的叶条完全浸入提前配置的30ml酶解液，所述的酶解液配置方法为：15g/L纤维素酶RS， 4g/L解离酶，0.4M甘露醇，20mM MES， 20mM KCl， 10mM CaCl₂， 1g/L BSA，余量为去离子水，pH为5.7，所述室温为22 ℃；所述的抽真空时间为1小时，所述的最小幅度为50 rpm，震荡过夜时间为12-16h。

4.根据权利要求1所述的星油藤叶片细胞来源的原生质体的制备方法，其特征在于：在步骤（2）中，获得原生质体后，进行GFP绿色荧光蛋白载体的瞬时转化，步骤如下：将上述原生质体溶液分装至2ml EP管，每支200ul；加入GFP载体5ul-10ul，浓度大于200 ng/μL，用指尖轻柔混合；

加入等体积200ul的PEG4000溶液，PEG4000溶液的配置方法：将0.2M甘露醇、400g/LPEG4000和100mMCaCl₂，用指尖轻柔混匀，诱导转化30min；加入400μL W5溶液轻柔颠倒混匀以终止反应，离心机调至soft模式，100g离心2min，弃上清液，加入200μL W5轻柔重悬沉淀，soft模式，100g离心2min，弃上清液。

5.根据权利要求1所述的星油藤叶片细胞来源的原生质体的制备方法，其特征在于：在步骤（2）中，W5溶液的配方为：9g/L NaCl， 13.9g/L Ca Cl₂， 0.37g/L KCl， 2mM MES， pH为5.7。

6.权利要求1所述的星油藤叶片细胞来源的原生质体的质粒转化方法，其特征在于包括如下步骤：（1）将权利要求1制备所得的原生质体溶液分装至2ml EP管，每支200ul；

（2）加入GFP载体5ul-10ul，浓度大于200 ng/μL，用指尖轻柔混合；

（3）加入200ul等体积的PEG4000溶液，所述的PEG4000溶液配置方法：将0.2M甘露醇、400g/L PEG4000和100mMCaCl₂用指尖轻柔混匀，诱导转化30min；

（4）加入400μL W5溶液轻柔颠倒混匀以终止反应，离心机调至soft模式，100g离心2min，弃上清液，加入200μL W5轻柔重悬沉淀，soft模式，100g离心2min，弃上清液；

（5）用400μL WI溶液，所述的WI溶液的配置方法：将0.3g/L KCl，36.45g/L甘露醇和0.75g/L MES轻柔重悬沉淀，锡纸包裹，倾斜放入28℃培养箱，弱光下过夜培养后进行荧光观测，培养时间为12-16h。