[发明专利]一种制备细胞因子释放综合征小鼠模型的方法及应用

说明书

本发明提出了一种制备细胞因子释放综合征小鼠模型的方法及应用。本发明尝试通过回输IL‑12 CAR‑T细胞诱发小鼠CRS，建立一种新的CRS模型。结果发现mCD19/IL‑12‑CAR‑T细胞体外和体内均分泌高水平IL‑12，低剂量1×10supgt;6/supgt;个mCD19/IL‑12‑CAR‑T细胞回输小鼠未诱发严重CRS，但可以抑制胰腺癌实体瘤的生长，高剂量回输mCD19/IL‑12‑CAR‑T细胞后，出现激发小鼠体内多种CRS相关炎性因子IL‑6、IL‑1a、IFN‑γ、IL‑10、TNF‑α、MCP‑1等迅速升高，体重减轻、肝脏肺脏等组织损伤，最终导致死亡等一系列典型CRS表现，从而建立一种新的CRS小鼠模型。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种制备细胞因子释放综合征小鼠模型的方法及应用。

背景技术

嵌合抗原受体T细胞(chimeric antigen receptor T cell，CAR-T)疗法开辟了肿瘤免疫治疗的新领域，针对B细胞表面标志物CD19的CAR-T细胞临床试验已显示出对多种血液系统恶性肿瘤的显著疗效。虽然CAR-T临床表现积极结果，但同时也带来许多不良反应。其中细胞因子释放综合征(Cytokine Release Syndrome，CRS)是最常见的一种严重并发症，由于CAR-T细胞治疗过程中活化的免疫细胞释放过量细胞因子而引起的超常免疫反应，表现为大量细胞因子短暂地、显著地升高，严重的CRS可危及患者生命。建立合适的动物模型是设计预防或减轻CRS策略的有效手段。负荷肿瘤的NSG小鼠通常用作CAR-T治疗的临床前模型，以及SCID-beige小鼠模型、CD20 CAR-T引起的免疫激活级联反应的恒河猴模型等。但建立这些模型价格昂贵，实验成本很高，不便于大规模开展相关的实验研究。

为了更好研究CRS发生的免疫机制及对治疗药物的疗效评估，需要建立技术方法简单、易于重复、便于大规模推广的的CRS小鼠模型。已报道的常用CAR-T相关CRS小鼠模型有两种，但是均重复性、稳定性较差。一种为SCID-beige小鼠腹腔内注射3×10⁶个Raji-GFP-Flu白血病细胞，肿瘤生长3周后通过生物发光成像评估肿瘤负担，再腹腔注射3×107个CD19.28z CAR-T细胞，CAR-T输注2～3天后，小鼠发生CRS，血清细胞因子升高，并最终死亡。但是这些小鼠不同个体肿瘤负荷偏差较大，导致小鼠死亡时间不均一，CRS治疗观察窗较窄，不利于实验研究。此外该模型采用人源CAR-T细胞，使得IFN-γ、IL-6等重要细胞因子及受体无法跨物种识别，这限制了该模型对人体CRS反应的模拟程度。另一种为通过肝内注射将人脐带血造血干细胞和祖细胞移植到亚致死剂量照射的新生NSG小鼠，或者表达人类干细胞因子、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子和IL-3的NSG-SGM3小鼠，重建淋巴造血系统，得到人源化NSG或者SGM3小鼠。这种模型对人CRS模拟程度更高，但小鼠品系很难获得，国内缺乏正式引进，造价昂贵，不利于实验的常规广泛开展。目前这两种小鼠模型已被多次报道应用，能较好反应临床CAR-T CRS的症状，另外也有研究用LPS诱发小鼠的CRS，但不能完全反应CAR-T CRS的病理特征和免疫学机制。目前缺乏造价低廉、稳定、能降低小鼠肿瘤负担的CAR-T CRS模型。

发明内容

发明目的：本发明的发明目的为提供一种体内细胞因子释放综合征小鼠模型及其构建方法，该模型消除小鼠肿瘤负担，简化实验过程，提高实验的稳定性，便于推广应用。

为了解决上述技术问题，本发明公开了一种制备细胞因子释放综合征小鼠模型的方法，其通过将2×10⁶～1×10⁷个CAR-T细胞通过尾静脉回输至小鼠体内得到，其中，所述CAR-T细胞表达识别鼠源抗原的CAR和外源性的IL12。

其中，其中所述鼠源抗原为mCD19。

所述CAR的结构为抗mCD19 scFv-BBz。