[发明专利]一种高效感染HT-22细胞的腺相关病毒突变体

说明书

本发明涉及病毒载体的包装及筛选，尤其涉及AAV突变体的包装及筛选，具体为一种高效感染HT‑22细胞的腺相关病毒突变体；通过构建AAV9的肽段突变文库,经过筛选验证获得插入了7个氨基酸的新的AAV9突变体,突变体可以有效的在MOI＝1E+5情况下有效感染HT‑22细胞，达到比天然AAV9血清型MOI＝1E+5更高的感染效果，经过筛选获得的AAV9‑HT01的效果最好，在同样的MOI条件下，感染阳性率相对于对照AAV9血清型明显提升，通过luciferase(RLU)值检测统计其倍数为4.4倍，有效降低AAV感染细胞的使用量，节省实验成本，同时使得在HT‑22细胞进行中枢神经类疾病基因治疗相关机制研究变得可行。

技术领域

本发明涉及病毒载体的包装及筛选，尤其涉及AAV突变体的包装及筛选，具体为一种高效感染HT-22细胞的腺相关病毒突变体。

背景技术

中枢神经系统疾病(Central nervous system,CNS)严重影响患者的身心健康和生活质量，且由于中枢神经系统自身的复杂性，血脑屏障(Blood-brainbarrier,BBB)对药物递送的障碍，常用的外科手术或者传统的药物来治疗神经系统的疾病仍很困难，所以目前各领域的科学家都在研究基于基因治疗方法来治疗神经系统性疾病的可行性。

腺相关病毒(adeno-associatedvirus,AAV)是一类微小、无被膜及具有二十面体结构的病毒，是目前发现的一类结构最简单的单链DNA缺陷型病毒。由于其安全性好、宿主细胞范围广(分裂和非分裂细胞)、免疫源性低，在体内表达外源基因时间长等特点，已经逐渐成为体内基因治疗递送的重要平台。然而，基因载体的递送效率是阻碍AAV介导中枢神经系统基因治疗发展的重要障碍。AAV与其他病毒载体不同，其不同的衣壳蛋白能够识别不同的宿主细胞表面受体，使得rAAV病毒载体能特异性感染不同组织。所以有许多研究分别利用细胞系，原代细胞，小鼠或者非人灵长类各种模型上筛选获得能高效感染的AAV衣壳蛋白，即AAV血清型。

HT-22细胞，是小鼠海马神经元细胞系，该细胞系是体外研究谷氨酸毒性的良好模型，在很多神经退化性疾病，例如阿兹海默(Alzheimer's Disease)和帕金森(Parkinson'sDisease)中均有很好的应用，也有很多研究者利用这株细胞进行相关的体外机制研究。我们前期发现，AAV9野生型血清型感染HT-22效率低，这样使得体外研究病毒用量较大，且病毒增大用量后对细胞状态有一定影响。

发明内容

针对现有技术中的缺陷，本发明设计并构建了一个AAV9的肽段突变文库，通过文库筛选获得可高效感染HT-22细胞系的AAV突变体，以便满足HT-22细胞系作为体外研究应用。

本发明公开了一种插入异源肽的AAV9血清型衣壳蛋白突变体；

所述异源肽为：氨基酸序列为SVADRMY(SEQ ID NO:12)所组成的多肽；

所述AAV9血清型衣壳蛋白氨基酸588～589之间被所述的异源肽插入。

本发明公开了编码上述AAV9血清型衣壳蛋白突变体的核酸分子。

本发明公开了可操作地连接上述核酸分子的核酸载体。

本发明公开了含有上述核酸载体的宿主细胞。

本发明公开了一种组合物或试剂盒，含有上述AAV9血清型衣壳蛋白突变体、核酸分子或核酸载体。

本发明公开了上述AAV9血清型衣壳蛋白突变体、核酸分子或核酸载体在用于感染HT-22细胞的用途，所述用途属于非诊断和治疗目的的。

本发明公开了上述AAV9血清型衣壳蛋白突变体、核酸分子或核酸载体在制备用于治疗中枢神经系统疾病的药物中的用途。

与现有技术相比，本发明有如下有益效果：