[发明专利]鸡蛋过敏原点刺液检测试剂盒制备方法

说明书

本发明公开了鸡蛋过敏原点刺液检测试剂盒制备方法，包括以下步骤：步骤一，鸡蛋过敏患者血清样本收集；步骤二，鸡蛋蛋清过敏原提取制备；步骤三，鸡蛋过敏原蛋白表达制备；步骤四，免疫斑点实验；步骤五，ELISA试验检测患者血清与过敏原的反应；步骤六，点刺液制备；其中在上述步骤一中，鸡蛋过敏患者进行血清样本收集；该鸡蛋过敏原点刺液检测试剂盒制备方法，从过敏原的分离与制备出发，提高抗原的纯度，并利用交叉免疫测试实验、结合阳性对照与阴性对照，降低检测的假阳性，提高检测的准确性；同时设计的鸡蛋过敏原点刺液检测试剂盒进一步提高了过敏原的检出率并增加了可靠性；对临床食物过敏原点刺检测具有重要的意义。

技术领域

本发明涉及测试剂盒制备技术领域，具体为鸡蛋过敏原点刺液检测试剂盒制备方法。

背景技术

食物过敏是指由食物的某种特定成分造成的对食物的不良反应。大多数食物过敏属于IgE介导的I型超敏反应。食品中能够诱导机体产生IgE并与之结合，使抗体进一步诱导效应细胞释放介质，从而引起速发型过敏反应的成分称为食物过敏原。食物过敏难以根治，在某些情况下甚至威胁生命。近年来，随着环境及人们生活水平的变化，食物过敏的人数大量增加，且患病率有逐年上升的趋势。目前食物过敏食物过敏的公共卫生问题得到了极大关注与重视。

过敏原点刺试验是过敏原特异性诊断的首选方法。但是大多数情况下，过敏原粗提原液被用作点刺皮试液，增加了检测的不确定性和交叉免疫性。本发明从过敏原的分离与制备出发，提高抗原的纯度，并利用交叉免疫测试实验、结合阳性对照与阴性对照，降低检测的假阳性，提高检测的准确性。

发明内容

本发明的目的在于提供鸡蛋过敏原点刺液检测试剂盒制备方法，以解决上述背景技术中提出的问题。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：鸡蛋过敏原点刺液检测试剂盒制备方法，包括以下步骤：步骤一，鸡蛋过敏患者血清样本收集；步骤二，鸡蛋蛋清过敏原提取制备；步骤三，鸡蛋过敏原蛋白表达制备；步骤四，免疫斑点实验；步骤五，ELISA试验检测患者血清与过敏原的反应；步骤六，点刺液制备；

其中在上述步骤一中，鸡蛋过敏患者进行血清样本收集；

其中在上述步骤二中，鸡蛋蛋清过敏原提取制备步骤如下：

1)取鸡蛋一个，收集蛋清，纱布滤去粘稠物，取适量清液加入等体积的PBS，调pH至6.0，4C静置过夜后8000rpm离心40min分离上清和沉淀，沉淀用PBS复溶，取上清调pH至4.0，在20ml的上清中加入30ml饱和AS溶液，使AS终浓度达到60％，之后搅拌30min，37C水浴30min后4C盐析过夜，8000rpm离心30min分离上清和沉淀；沉淀用0.01M PBS复溶后装入MWCO为l0 kD超滤，然后置于透析袋于PBS中透析除盐；

2)蛋白粗提物重新悬浮在缓冲液2(0.1％triton-100,20mM Tris-HCl pH 8.0)中，在4℃下与10倍缓冲液2透析10小时；4次透析后，样品用0.45μm孔径过滤器过滤，加载到色谱柱(GE Healthcare)，用Tris缓冲液洗脱，线性梯度为0-0.8M NaCl在120mL中洗脱；收集含有14.4kDa蛋白的峰，随后确认为牛奶过敏原乳清蛋白，SDS-PAGE测定洗脱蛋白纯度；

其中在上述步骤三中，鸡蛋过敏原蛋白表达制备步骤如下：

1)使用基因组DNA纯化试剂盒提取鸡蛋清基因组DNA；向蛋清中加入蛋白质沉淀溶液，混合物离心，上清转移到含有异丙醇的清洁管中；经过温和的混合后，将溶液离心，除去上清，然后加入70％的乙醇；然后离心除去乙醇，用65℃预热的DNA复水化溶液重新悬浮DNA球团引物设计基于牛奶基因组序列，测定基因组DNA浓度；

2)基于鸡蛋基因组DNA序列，设计引物对基因序列进行扩增，对PCR产物进行测序加以验证；