[发明专利]引物探针组合、试剂及应用

说明书

本发明涉及体外检测技术领域，特别涉及引物探针组合、试剂及应用。本发明提供了检测HPV DNA与mRNA的引物探针组合、试剂或试剂盒，目的在于能够在单个反应中简便、快速、准确地检测多个型别的HPV DNA与mRNA，以达到分型的目的。本发明运用不对称PCR技术‑熔解曲线技术，可以在单管中对HPV 16、18、31、33、45、52、58、59、68型这9种型别的DNA或mRNA片段进行荧光PCR检测、分型。

技术领域

本发明涉及体外检测技术领域，特别涉及引物探针组合、试剂及应用。

背景技术

宫颈癌是影响全球妇女的常见癌症之一，且研究已表明99.7％的宫颈癌都是由人乳头瘤病毒(Human papilloma virus，HPV)造成的，HPV还可以导致其他多种癌症的发生，比如阴茎癌、阴道癌、外阴癌、肛门癌和口咽癌等。

HPV是一种小分子的、无被膜包被的环状双链DNA病毒，基因组长约8000碱基对(bp)，分为3个功能区，即早期转录区(E区)、晚期转录区(L区)和非转录区(长控制区，LCR)。HPV的E6和E7基因是致癌基因，能够调控p53和pdz结构域蛋白，并靶向成视网膜母细胞瘤蛋白家族(retinoblastoma protein，pRb)发挥作用。

检测HPV的方法主要有巴氏涂片、原位杂交、细胞学检测、HPV核酸检测等，并且p16免疫组织染色也可以作为潜在的替代标记以检测HPV。目前，HPV核酸检测以及TCT检测是比较有效的检测方法，在宫颈癌筛查中发挥着很大的作用。

然而，当需要在单个反应管中同时检测多个突变或多个样本时，实时PCR在技术上会有所限制。这些限制可以通过PCR后、基于探针的荧光熔解曲线分析(fluorescencemelting curve analysis，FMCA)来解决，该技术基于熔解温度(Melting Temperature，Tm)的偏移来检测多个突变。如果使用不同荧光基团标记的多个探针，则可以检测到的突变数量将会进一步增加。

有文献报道，从低级别病变逐步发展为癌的过程中，HPV基因组会发生整合。在整合过程中，E6/E7基因持续存在，L1基因可能会丢失，在检测过程中存在漏检风险。研究发现，HPV18的L1/E1区更容易丢失，几乎所有的HPV18阳性的宫颈癌中病毒基因组会整合到人基因组上，而HPV16阳性的宫颈癌中也有≤60％的病毒基因组发生整合，因此检测mRNA则会有更高的灵敏度。

国内已有多种基于实时荧光定量PCR技术检测HPV核酸的方法，但分型有限，而多色熔解曲线技术的应用则可以解决这一问题。现有技术专利公开以mRNA为模板进行扩增，虽能进行多个分型，但引物探针设计难度大、成本较高，反应体系成分复杂。而以DNA为模板进行扩增，存在漏检风险，尤其是HPV16与HPV18型的漏检，对后续诊断治疗影响很大。

目前，市面上熔解曲线产品一般以DNA或RNA为靶标进行核酸检测，不同程度上存在灵敏度低、特异性低等缺点。

现有技术存在的问题还包括：

1)分型有限。大部分HPV分型试剂采用分管的形式，成本较高；

2)需-20℃储存。目前市面同类试剂盒一般是储存在-20℃条件下；

3)操作复杂。大部分试剂原理复杂、引物探针设计难度大。

发明内容

有鉴于此，本发明提供的引物探针组合、试剂及应用，能在单个反应中简便、快速、准确地检测多个型别的HPV DNA与mRNA，以达到分型的目的。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了引物，包括引物1、引物2、引物3、引物4、引物5、引物6、引物7、引物8、引物9、引物10、引物11、引物12、引物13、引物14、引物15、引物16或引物17；