[发明专利]一种重组人源化胶原蛋白的制备方法

权利要求书

1.一种重组人源化胶原蛋白的制备方法，其特征在于：包括以下方法步骤，

S1，将毕赤酵母菌基因工程菌接种于种子罐中培养，待溶氧大幅度回升后转移至生产发酵罐；

S2，将生产发酵罐内的毕赤酵母菌基因工程菌培养至溶氧大幅度回升后，使用复合原料进行混合碳源补料；

S3，结束混合碳源补料后，使用发酵液进行补料并持续进行发酵处理，发酵过程中保持注入补料气体，保持300ml/min注入；

S4，使用缓冲液进行混合，然后进行提纯处理；

S5，对提纯后的原料进行消毒处理，即完成加工。

2.根据权利要求1所述的一种重组人源化胶原蛋白的制备方法，其特征在于，所述毕赤酵母菌基因工程制作方法如下，L1，先将毕赤酵母菌种放入3‰-10‰的培养基进行浸泡10-20min，再把原料清洗至中性，培养得到一级种子；

L2，将一级种子液按照10％～16％的接种量接种于35L种子罐中的底料培养基中，培养得到二级种子；

L3，待二级种子液溶氧大幅度回升后，按照17％～18％的接种量接种于150L种子罐中的底料培养基中，培养得到三级种子，再将三级种子放入发酵罐中进行发酵处理，发酵过程中采用6-8mol/L的碳酸氢钾溶液，调节发酵液的pH，使发酵过程pH 2-6。

3.根据权利要求1所述的一种重组人源化胶原蛋白的制备方法，其特征在于，步骤S1中，按照物料比1:3(w/v)-1:4(w/v)加入纯化水，90-95℃灭菌20-30min，冷却至30℃。

4.根据权利要求1所述的一种重组人源化胶原蛋白的制备方法，其特征在于，步骤S1中，初次发酵过程中，PH控制在6.0-7.8，37-42℃保温水解6-7h，然后离心过滤，取过滤清液；使用截留分子量为6000的超滤设备进行超滤，并补加纯化水使超滤更加完全，取透出液。

5.根据权利要求1所述的一种重组人源化胶原蛋白的制备方法，其特征在于，步骤S3中，所述补料气体为氨气、氮气、氧气及二氧化碳构成的混合物，且混合比例为1:1.2:1.4:1.5。

6.根据权利要求1所述的一种重组人源化胶原蛋白的制备方法，其特征在于，步骤S4中，加入缓冲液重悬至120-230g/L→悬浮物使用高压均质机裂解，离心收集裂解物上清，上清过滤去除不溶物杂质→上清中加入终浓度为80-180mM硝酸镁，搅拌均匀后离心收集上清，PH调整至5.5→将pH处理后上清加入硝酸镁颗粒盐析至终浓度达到1.4-1.6M，离心收集盐析沉淀→盐析沉淀使用纯化水溶解,1L水对1kg初始湿菌体,3h以上，离心收集上清并过滤除去颗粒或絮状杂质，将该上清放入到10-25℃内维持6h以上，此时蛋白析出，低温离心收集沉淀即可获得粗品，再进行纯化m。

7.根据权利要求1所述的一种重组人源化胶原蛋白的制备方法，其特征在于，步骤S2，所述复合原料为生理盐水、双氧水、碳酸铵构成的混合物。

8.根据权利要求2所述的一种重组人源化胶原蛋白的制备方法，其特征在于，所述培养基的成份为以下，葡萄糖1.5-3.0份，蛋白胨1.0-2.5份，酵母粉2.5-4份，琼脂粉0.5-2.0份，硫酸钾1.5-4份、维生素C0.5-1份、硫酸镁1-3份。